苦參堿逆轉外排泵系統(tǒng)AcrAB-ToIC介導的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌對替加環(huán)素的耐藥性*

伍慧妍,鐘瑤,詹鈾超,彭亮,張艷玲

(1.廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院檢驗科,廣州 510799;2.廣州醫(yī)科大學金域學院醫(yī)學檢驗系,廣州 510180;3.嘉應學院醫(yī)學院醫(yī)學檢驗系,梅州 514031)

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院內獲得性感染重要條件致病體[1],碳青霉烯類藥物是治療肺炎克雷伯菌的重要抗菌藥物[2]。由于近年來臨床上碳青霉烯類藥物使用的增加以及藥物的選擇性壓力下,耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(Carbapenem-resistantKlebsiellaPneumoniae,CRKP)在全球范圍內不斷出現(xiàn),在國內的檢出率占比也不斷升高[3-4]。目前,替加環(huán)素(tigecycline,TGC)是治療CRKP的首選用藥方案之一[5-7]。據(jù)中國細菌耐藥監(jiān)測研究2019—2020革蘭陰性菌監(jiān)測報告顯示,CRKP對替加環(huán)素耐藥率為8.9%,并呈逐年遞增趨勢[3],給臨床治療CRKP導致的感染提出了一大挑戰(zhàn)。新型替加環(huán)素聯(lián)合用藥模式可為減小抗生素“選擇性壓力”提供新思路。AcrAB-TolC系統(tǒng)是CRKP最重要的、最經(jīng)典的多藥外排系統(tǒng)[8]。CRKP對替加環(huán)素的耐藥性主要是由上述外排泵及其相應的調節(jié)基因MarA、RamA和AcrB、AcrR方面發(fā)揮著作用[9]。中藥單體苦參堿(matrine,MAT)具有廣譜抗菌作用,且MAT能下調大腸埃希菌中AcrAB-TolC的表達[10]。因此本研究選擇中藥單體苦參堿作為研究對象,評估其對外排泵系統(tǒng)AcrAB-TolC介導的CRKP對替加環(huán)素耐藥性的影響,探究其逆轉耐藥性的相關調控機制,為后續(xù)研究中藥抗多重耐藥機制,提高CRKP感染的療效,降低患者死亡率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究菌株 本實驗菌株來源于廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院檢驗科菌種資源庫。實驗組(CRKP-TR):經(jīng)檢驗科微生物室Microflex LT/SH全自動生物質譜檢測系統(tǒng)鑒定為肺炎克雷伯菌;并通過VITEK-2 COMPACT全自動藥敏系統(tǒng)檢測出為碳青霉烯類耐藥且替加環(huán)素耐藥或中介;并經(jīng)分子生物學實驗室羅氏cobas Z480熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)儀檢測(與對照組相比)高表達AcrB、MarA、RamA,低表達AcrR基因;一共31株。對照組(CRKP-TS):選用由廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院檢驗科微生物室通過對肺炎克雷伯質控株(ATCC4352)體外多步誘導法誘導的對碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌,并對替加環(huán)素藥敏敏感的菌株。菌株統(tǒng)一保存于-20℃冰箱。本研究通過倫理委員會批準,批件號:KY02-2022-03-04。

1.2實驗耗材 苦參堿(江蘇永健對照品公司,含量>99%,批號:102750);替加環(huán)素(上海士鋒生物制品有限公司,含量>98%,批號:220620-09-7); 水解酪蛋白培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司,批號:1103531);哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(江門市凱林貿(mào)易有限公司,貨號:P0901);細菌總RNA提取試劑盒(浙江聯(lián)碩生物科技有限公司,批號:19301ES50);逆轉錄試劑盒(批號:W9813)、qRT-PCR 試劑盒(批號:W9730)來源于北京天根生化科技有限公司;引物合成均來自廣州艾基生物技術有限公司;Microflex LT/SH全自動生物質譜檢測系統(tǒng)(美國布魯克·道爾頓公司);VITEK 2 COMPACT細菌藥敏分析儀(法國BIOMERIEUX公司);ELX800酶標儀(美國Bio-Tek寶特公司);Cobas Z480實時PCR擴增儀(瑞士羅氏公司)。

1.3藥物配制 稱取苦參堿粉末1 g,溶于20 mL純化水中配制成濃度50 000 mg·L-1的母液,充分混勻,分裝至EP管中保存,標好藥名及配制日期,保存于2～8 ℃冰箱,實驗時用純化水稀釋成相應濃度。 稱取替加環(huán)素250 mg溶于0.9%氯化鈉溶液12.5 mL中,配制成濃度為20 000 mg·L-1母液,充分混勻,分裝至EP管中并標記好名稱和配制日期,放于-20 ℃冰箱保存,根據(jù)實驗需要用0.9%氯化鈉溶液稀釋成相應濃度。

1.4菌液制備 取冷藏保存的替加環(huán)素敏感的CRKP和替加環(huán)素耐藥或中介的CRKP接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上,放置于普通培養(yǎng)箱中,在37 ℃下培養(yǎng)24 h后,獲得目標菌落的單個純菌落,在生物安全柜中用無菌接種環(huán)挑取單菌落于無菌0.9%氯化鈉溶液配成菌懸液,利用麥氏比濁法調節(jié)菌懸液濃度為0.5個麥氏濁度(相當于 1.5×108CFU·mL-1)。

1.5聯(lián)合抑菌試驗 使用棋盤稀釋法,每個96孔板中每孔加入水解酪蛋白培養(yǎng)基150 μL。從A排到G排第2列加入150 μL苦參堿倍比稀釋至第11列。從第2列到11列第A排起加入替加環(huán)素5 μL倍比稀釋至第G排。最終苦參堿終濃度為9.77,19.53,39.06,78.125,156.25,312.5,625,1 250,2 500,5 000 mg·L-1,10個梯度濃度,替加環(huán)素終濃度為2,4,8,16,32,64,128 mg·L-1,7個梯度濃度。在第H排設置以上濃度的苦參堿單藥對照組,第12列設置以上濃度的替加環(huán)素單藥對照組。第1列A-D孔只加水解酪蛋白培養(yǎng)基為陰性對照。第1列E-H孔只加入試驗菌液為陽性對照。取菌液5 μL(CRKP-TS或CRKP-TR)接種于96孔中。培養(yǎng)24 h后,使用ELX800酶標儀測定波長450 nm、參比波長620 nm測定各孔吸光度值,測定藥物最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC),并計算部分抑菌濃度(fractional inhibitory concentration,FIC)指數(shù)和抑菌率[11]。

1.6外排泵基因的表達測定 細菌總RNA提取試劑盒提取細菌RNA,包括CRKP-TS、CRKP-TR及其棋盤稀釋法相對應得到的耐藥逆轉孔對應的單藥、聯(lián)合藥孔。RNA的逆轉錄后得到的逆轉錄產(chǎn)物cDNA放置于-20 ℃下的冰箱保存。 qRT-PCR所需引物序列結合文獻[12]報道并根據(jù)相關引物設計原則,在美國國家生物技術信息中心(NCBI)網(wǎng)站Gene數(shù)據(jù)庫中找到相關基因序列并使用在線引物設計功能設計引物,見表1。使用三步法PCR反應擴增程序:一為預變性:95 ℃,3 min,循環(huán)數(shù)為1。二為PCR反應:95 ℃,5 s(變性);60 ℃,10 s(退火);75 ℃,15 s(延伸),循環(huán)數(shù)為40,羅氏cobas Z480實時PCR擴增儀中進行檢測。以16sRNA作為內參基因進行校準,AcrB、MarA、RamA、AcrR基因相對表達豐度用ΔΔCT法分析。

表1 AcrAB-ToIC外排泵基因的引物序列

2 結果

2.1兩組CRKP替加環(huán)素與苦參堿的MIC值 對照組(CRKP-TS)的替加環(huán)素MIC為2 mg·L-1,苦參堿的MIC為(3 500±1 369.31) mg·L-1;實驗組(CRKP-TR)的替加環(huán)素MIC為(38.18±21.76) mg·L-1,苦參堿的MIC為(3 181.82±1 139.61) mg·L-1。可見實驗組(CRKP-TR)與對照組(CRKP-TS)相比較,該31株替加環(huán)素耐藥的CRKP,替加環(huán)素的MIC值均明顯升高,但苦參堿的MIC值無明顯變化(表2)。對實驗組與對照組共32株CRKP進行苦參堿MIC的檢測,最后發(fā)現(xiàn)苦參堿對CRKP的MIC值為3 125 mg·L-1。

表2 兩組CRKP替加環(huán)素與苦參堿的MIC值

2.2替加環(huán)素與苦參堿聯(lián)合應用前后CRKP-TR組藥物MIC值變化情況 與單用替加環(huán)素或苦參堿相比較,替加環(huán)素與苦參堿聯(lián)合用藥后,無論是替加環(huán)素還是苦參堿,其MIC值均明顯降低,而且31株CRKP-TR組的替加環(huán)素MIC值均能恢復至替加環(huán)素敏感MIC值與表2對照組中替加環(huán)素MIC值無區(qū)別,見表3。

表3 替加環(huán)素與苦參堿聯(lián)合應用前后MIC值的變化情況

2.3替加環(huán)素與苦參堿聯(lián)合應用前后對CRKP-TR組抑菌率的變化情況以及FIC指數(shù)的影響 單用替加環(huán)素作用CRKP-TR組,抑菌率為0.638±0.085;單用苦參堿抑菌率為0.628±0.032。在單藥作用下,對CRKP-TR組的抑菌效果相同(P=0.812)。當兩種藥物聯(lián)合用藥時,抑菌率可達0.856±0.136;與單用替加環(huán)素組或苦參堿組相比較,相同濃度的替加環(huán)素與苦參堿聯(lián)合應用后對CRKP-TR組抑菌率明顯提高(P<0.05),見圖1。

①與兩單藥組比較(與替加環(huán)素比較:t=5.44;與苦參堿比較:t=4.83),均P<0.05。

CRKP-TR組中經(jīng)過VITEK-2 COMPACT全自動藥敏系統(tǒng)檢測出為替加環(huán)素耐藥25株(81%)、中介6株(19%),31株CRKP-TR經(jīng)過替加環(huán)素與苦參堿聯(lián)合應用主要表現(xiàn)為協(xié)同作用有14株占45%,相加作用有17株占55%;替加環(huán)素中介在經(jīng)過苦參堿聯(lián)合作用后抑菌效果更為明顯,6株均呈現(xiàn)協(xié)同作用。另外,無關作用和拮抗作用均無出現(xiàn)(表4)。說明苦參堿能提高替加環(huán)素對替加環(huán)素耐藥的CRKP的藥物療效。

表4 替加環(huán)素與苦參堿聯(lián)合應用后FIC指數(shù)

2.4逆轉耐藥前后AcrAB-TolC外排泵膜蛋白基因的表達情況 qRT-PCR檢測結果顯示,與CRKP-TS組比較,CRKP-TR組31株AcrAB-TolC外排泵的正向調控MarA、RamA、AcrB的基因相對表達量均明顯升高(P<0.05),而負向調控AcrR基因相對表達量明顯降低(P<0.05),見圖2。

①與對照組(CRKP-TS)比較,MarA:t=4.16;AcrB:t=5.22;AcrR:t=5.59;RamA:t=5.70,P<0.05。

替加環(huán)素與苦參堿聯(lián)合應用前后CRKP-TR中的AcrAB-TolC外排泵MarA、RamA、AcrB及AcrR基因的表達變化情況的評估結果如圖3所示。單用替加環(huán)素與無藥物處理CRKP-TR相比較,MarA、RamA、AcrB及AcrR基因的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。單用苦參堿與用藥前相比較,除MarA基因的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),RamA、AcrB表達分別約下調8倍、 3倍,而AcrR表達增加6倍(P<0.05),證明苦參堿能引起RamA、AcrB及AcrR基因表達改變。聯(lián)合用藥后CRKP-TR組與無藥物處理CRKP-TR組相比較,MarA、RamA、AcrB基因的表達均明顯降低(P<0.05)AcrR基因表達升高7.86倍(P<0.05)。說明苦參堿與替加環(huán)素聯(lián)合應用后對外排泵AcrAB-TolC表達的抑制作用更為顯著。

①與用藥前比較,MarA:t=5.61;AcrB:t=4.78-6.40;AcrR:t=2.43-3.17;RamA:t=7.81-7.98,P<0.05。

因替加環(huán)素中介在經(jīng)過苦參堿聯(lián)合作用后抑菌效果比替加環(huán)素耐藥時更為明顯,均呈現(xiàn)協(xié)同作用。本研究分別檢測苦參堿作用后和苦參堿聯(lián)合替加環(huán)素作用后,CRKP-TR組中替加環(huán)素中介的外排泵表達的變化,但發(fā)現(xiàn)外排泵膜蛋白基因表達層面沒有差異性改變(P>0.05),見圖4。

圖4 CRKP-TR組中替加環(huán)素耐藥(R)與中介(I)在聯(lián)合藥物作用后外排泵膜蛋白基因表達情況

3 討論

醫(yī)院感染中CRKP的檢出率不斷升高,致病菌耐藥性已是不爭的事實,也是全球面臨的挑戰(zhàn)。替加環(huán)素雖有獨特的抗菌特性,是作為臨床常見的多重耐藥陰性桿菌菌感染基礎經(jīng)驗治療用藥[13],在臨床上使用方便,不需要根據(jù)腎功能的受損情況來調整劑量[5,9],但同樣也已出現(xiàn)替加環(huán)素耐藥株。單一使用過度,勢必會加快新藥耐藥的步伐。這就給治療多重耐藥菌導致的感染提出了一大難題。因此,為減少對于臨床對傳統(tǒng)抗菌藥物的過度依賴,尋找可能有效的抗菌新方案,是目前解決CRKP導致的感染治療的一大需求。近年有研究表明,板藍根和土霉素的聯(lián)合作用對枯草芽孢桿菌存在協(xié)同的抗菌效果[14];楊梅素和美羅培南聯(lián)合應用可以逆轉對美羅培南的耐藥[15]?？梢娭形魉幝?lián)合治療也是一種對抗多重耐藥菌的新型手段。因此,本文選擇苦參堿為中藥研究藥物,且苦參堿已經(jīng)在臨床中投入使用,毒副作用低[10]。

本研究結果顯示,替加環(huán)素和苦參堿聯(lián)合使用,二者的藥理作用表現(xiàn)為協(xié)同或相加作用;其中CRKP替加環(huán)素中介的FIC都小于0.5,表明替加環(huán)素與苦參堿聯(lián)合作用對中介的抑菌效果更為明顯。鑒于臨床對替加環(huán)素中介用藥需要增加藥物頻次使用,這會極大增加其選擇性壓力。因此,與苦參堿聯(lián)合使用,或許能延長替加環(huán)素的使用壽命。聯(lián)合用藥與單藥組相比,對CRKP替加環(huán)素耐藥的抑菌率明顯升高,說明苦參堿和替加環(huán)素聯(lián)合使用后抗菌效果理想。聯(lián)合用藥后,替加環(huán)素與苦參堿的MIC值均明顯降低,其中,替加環(huán)素的MIC值均能恢復至CRKP替加環(huán)素敏感MIC值。以上結果說明苦參堿能逆轉CRKP對替加環(huán)素耐藥性。與之前研究結果[10],即苦參堿能夠使多重耐藥的大腸埃希菌對抗菌藥物恢復敏感的結果具有一致性。

細菌的耐藥機制較為復雜和多樣,CRKP的耐藥機制主要涉及碳青霉烯酶的產(chǎn)生、產(chǎn)AmpC酶或ESBLs合并外膜孔蛋白缺失或改變、外排泵的過度表達、生物被膜的形成等多種機制介導[8]。外排泵的過度表達在CRKP對替加環(huán)素耐藥性方面發(fā)揮著主導地位[9]?，F(xiàn)在也普遍認識到在基因水平上調控外排泵表達是治療多重耐藥的一個手段,AcrAB-TolC是革蘭陰性菌中RND家族最具臨床意義的外排泵系統(tǒng),當此外排系統(tǒng)發(fā)生過表達時,導致菌體內濃度下降,不足以在體內達到有效的殺菌效果,就有利于細菌在存在抗菌藥物的環(huán)境中生存。因此本研究通過外排泵AcrAB-TolC調控作為突破點探索治療CRKP的新策略。本研究結果顯示,苦參堿和替加環(huán)素聯(lián)合應用能夠調控CRKP外排泵AcrAbB-TolC的基因表達,下調MarA、RamA和AcrB的基因表達,抑制AcrAB的轉錄,上調AcrR的表達,逆轉由外排泵系統(tǒng)AcrAB-TolC介導的CRKP對替加環(huán)素的耐藥,使CRKP重新對替加環(huán)素敏感。這與研究[10]發(fā)現(xiàn)苦參堿能夠調控大腸桿菌中AcrAB-TolC中的調控因子MacA、AcrR、RamA以達到抑制外排作用相同。并且用單藥苦參堿組處理后,除了MarA基因表達無明顯差異外,抑制了RamA、AcrB基因的表達,或許CRKP對替加環(huán)素耐藥的機制跟RamA或AcrB更有相關性,以往也有研究提出了肺炎克雷伯菌的AcrAB-TolC主要是RamA控制的觀點[16]。且本研究針對耐藥逆轉前后AcrAB-TolC外排泵膜蛋白基因的表達情況,僅使用RT-PCR檢測手段進行探討,需要后續(xù)進一步補充其他實驗檢查已達相互佐證,因此,檢測結果存在的一定缺陷,暫只是初步論證。另外,本課題推斷苦參堿可作為外排泵AcrAB-TolC的調控因子。但目前關于苦參堿如何下調AcrAB-TolC外排泵的作用原因還未能查證,所以對探索苦參堿和CRKP的AcrAB-TolC外排泵調控機制之間關聯(lián)性需做出進一步的研究。

綜上所述,苦參堿與替加環(huán)素聯(lián)合應用后替加環(huán)素的MIC下降,兩者可起到協(xié)同或相加的作用,使得抗菌藥物的效果得以改善,為臨床耐藥菌治療提供中藥與抗菌藥物聯(lián)合用藥的新思路。外排泵基因的表達與致病菌的生物膜的生長呈正相關,而中藥單體聯(lián)合抗菌藥物對生物膜形成有抑制作用[17]。本研究結果顯示,苦參堿與替加環(huán)素聯(lián)合應用后,CRKP替加環(huán)素中介與替加環(huán)素耐藥的菌株相比,抑菌效果更明顯,均為藥理協(xié)同作用;但通過比較基因表達情況,并未發(fā)現(xiàn)外排泵膜蛋白基因表達層面有差異。猜測聯(lián)合用藥后對CRKP替加環(huán)素中介的抑菌效果更好,跟逆轉外排泵系統(tǒng)的表達無關,或許跟生物膜具有一定關系,具體原因仍需進一步實驗驗證。所以關于苦參堿是否能夠在下調外排泵系統(tǒng)AcrAB-TolC表達后進一步影響生物膜的形成,從而有助于苦參堿逆轉AcrAB-TolC介導的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌對替加環(huán)素的耐藥性是我們下一步需要進行研究的方向。