咖啡酸國家一級純度標準物質的研制*

蘇斌,張寶喜,畢研才,龔寧波,楊世穎,張麗,呂揚,杜冠華

(1.山東濟世藥業有限公司質量部,濟南 271100;2.北京協和醫學院·中國醫學科學院藥物研究所晶型藥物研究北京市重點實驗室,北京 100050;3.北京協和醫學院·中國醫學科學院藥物研究所藥物靶點研究與新藥篩選北京市重點實驗室,北京 100050)

咖啡酸屬酚酸類化合物,廣泛存在于多種中藥材植物中,如一枝黃、杜仲、薄荷、蒲公英等。研究發現,咖啡酸具有廣泛的藥理活性,如抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗癌等作用,近年來又逐漸發現其在糖尿病腎病、心肌細胞保護、免疫系統疾病等方面具有較好活性[1-5]。鑒于咖啡酸化學成分存在于多種中藥材中,《中華人民共和國藥典》將其列為冬葵果等中藥材質量評價的有效或指標成分,在冬葵果、杠板歸、牽牛子等多種中藥材的鑒別檢查中亦作為對照品使用[6]。因此,研究咖啡酸純度標準物質對于我國中藥相關產品的質量控制具有重要的科學意義。

標準物質是具有可溯源性和準確量值的測量標準,其基本功能是可以復現、保存與傳遞量值,保證在不同時間與空間中量值的可比性與一致性。標準物質的特性量值是作為分析測量中的“量具”和“標準”,在校準儀器、評價方法、確定材料成分、考核人員水平以及生產過程中的質量控制方面起著重要的標準的作用[7-8]。2005年國際標準化組織/標準物質委員會(ISO/REMCO)對標準物質、有證標準物質、基準標準物質賦予了新的定義[9-10]。

我們根據中華人民共和國計量法、一級標準物質研制技術規范(JJF 1006-1994)、標準物質管理辦法與《中華人民共和國藥典》等相關技術文件[11-14],研制了咖啡酸化學純度有證標準物質,具有溯源性和量值傳遞功能,可應用于相關化學藥品、中藥產品、保健品的質量監控,為實現我國準確定量檢測藥品與相關物質提供了標準物質資源和物質純度標準。

根據有證標準物質研制要求,筆者在本實驗完成了咖啡酸純度標準物質的均勻性檢驗、短期穩定性考察、長期穩定性考察等系列研究,并采用質量平衡法與庫侖滴定法兩種不同原理的檢測分析技術,實現了對咖啡酸化學純度標準物質聯合定值,建立了不同技術方法的不確定度評估數學模型,確保了標準物質定值結果的科學性和準確性。

1 儀器與試劑

1.1儀器 Agilent 1200 型高效液相色譜儀(配置:四元梯度泵,自動進樣器,DAD檢測器,Agilent chemstation色譜工作站);庫侖滴定儀(自制,雙鉑電極,電流指示器);XS 105型分析用天平(METTLER TOLEDO公司,感量:0.01 mg);TU-1901 型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。研究使用的高效液相色譜儀、紫外分光光度計、分析用天平等儀器及玻璃器皿、移液槍等均經國家計量院校準,庫侖滴定儀經國家一級亞砷酸根溶液標準物質(GBW 08666)校準。

1.2試劑 乙腈(色譜純,Fisher Chemical);異丙醇(色譜純,Fisher Chemical);冰醋酸(分析純,北京化學試劑公司);溴化鉀(分析純,北京化學試劑公司);鹽酸(分析純,北京化學試劑公司);純水;流動相使用前均過孔徑0.2 μm微孔濾膜。

2 方法與結果

2.1高純度標準物質候選物制備 咖啡酸標準物質候選物原料由東北產地的蒲公英中藥材提取、分離、純化獲得。 采用四大光譜技術進行咖啡酸純度標準候選物樣品進行結構確證研究:UV(乙腈)λmax:320.5 nm、294.0 nm、239.0 nm、216.5 nm、191.5 nm;IR:3 431.7,3 231.7,3 025.0,2 830.4,2 563.9,1 644.7,1 619.4,1 600.7,1 530.7,1 449.6,1 374.7,1 352.0,1 326.1,1 296.1,1 280.0,1 217.7,1 174.3,1 120.3,974.8,968.6,935.4,900.2,871.9,849.7,816.8,801.7,779.9,736.6,699.1,647.8,603.0,576.0,458.6 cm-1;H-NMR(d6-DMSO):δppm:6.2(1H,d,J=15.9Hz,H-6),6.7(1H,d,J=8.2Hz,H-7),6.9(1H,dd,J=8.2Hz,J=1.85Hz,H-2),7.0(1H,d,J=1.85Hz,H-8),7.4(1H,d,J=15.85Hz,H-5),9.1(1H,s,H-1),9.5(1H,s,H-3),12.1(1H,s,O-H)。13C-NMR(d6-DMSO):δppm:114.6(C-1),115.1(C-6),115.7(C-7),121.1(C-5),125.7(C-2),144.6(C-4),145.5(C-3),148.1(C-8),167.9(C-9);ESI-MSm/z:181.0(M++1);以上數據與文獻報道基本一致[15],可確定標準物質候選物樣品為咖啡酸。

2.2定值方法的方法學研究 咖啡酸純度標準物質采用質量平衡法與庫侖滴定法2種不同原理的方法進行聯合定值。其中質量平衡法是首先采用高效液相色譜面積歸一化法,測定候選物中主成分含量,再扣除候選物中無紫外吸收的雜質成分含量,從而獲得待測標準物質候選物的化學純度。

2.2.1高效液相色譜法研究

(1)色譜條件 色譜柱:Agilent Eclipse XDB C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)。流動相:梯度洗脫,A相:0.5%冰醋酸溶液(含5%異丙醇);B相:乙腈。5%Bisocratic (9 min);5%～25%B linear(5% min-1,4 min);25%B isocratic(9 min);25%～5%B linear(5% min-1,4 min);5%B isocratic(9 min)。流速:1.0 mL·min-1,柱溫:35 ℃,進樣量:10 μL。有關物質檢測濃度:500 μg·mL-1。記錄色譜圖及峰面積,利用Agilent Chemstation色譜工作站處理數據,采用面積歸一化法進行純度測定。

(2)線性范圍 精密稱取咖啡酸純度標準物質樣品25.0 mg,10%乙腈溶解并定容至25 mL量瓶,搖勻,配制成濃度為1 000 μg· mL-1的儲備液。分別精密量取儲備液0.1,0.5,1.0,2.5,5.0,7.0 mL,用10%乙腈定容至10 mL容量瓶中,配制成系列濃度分別為10.0,50.0,100.0,250.0,500.0,700.0 μg·mL-1的標準溶液。分別精密度量取各濃度溶液10 μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖及峰面積。按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析。以樣品濃度(X,μg·mL-1)為橫坐標,以峰面積(Y)為縱坐標,繪制標準曲線,回歸線性方程為Y=32.556X+33.788,相關系數R2=0.999 9(n=6)。結果表明,在10.0～700.3 μg·mL-1濃度范圍內,咖啡酸峰面積與濃度呈現良好的線性關系。

(3)儀器精密度 精密稱取咖啡酸純度標準物質12.5 mg,加10%乙腈溶解,并定容至25 mL量瓶中,配制成濃度為500.0 μg·mL-1的溶液,搖勻,備用。精密量取溶液10 μL注入液相色譜儀,重復進樣6次。計算6次重復實驗的平均峰面積RSD值為0.04%,<2.0%,表明利用高效液相色譜法測定咖啡酸純度標準物質的檢測分析儀器精密度良好。

(4)方法精密度 按“2.1.3”項下方法配制供試品,共6份。精密量溶液10 μL注入液相色譜儀,重復進樣3次。計算獲得6份樣品平均峰面積的RSD值為0.15%,<2.0%,表明利用高效液相色譜法測定咖啡酸純度標準物質的檢測分析方法具有良好的精密度。

2.2.2庫侖滴定法

(1)反應原理 電極材料:雙鉑電極;發生電極反應:2Br—=Br2+2e;電解電流:0.9872 mA;指示終點:電流上升法,電流超過20 μA停止電解;電解質組成:8N鹽酸：2M 溴化鉀：冰醋酸=1：1：2。咖啡酸分子量為180.15。反應原理見圖1。

(2)線性范圍 精密稱取10.28,12.43,14.11,16.91,18.31,20.91 mg,置于10 mL量瓶中,使用甲醇定容,待用。分別移取100 μL的供試溶液樣品進行實驗。利用咖啡酸樣品量與溴庫侖滴定反應時間之間的定量關系進行測定,記錄反應時間。以咖啡酸純度標準物質的進樣量為橫坐標,以平均反應時間為縱坐標,繪制標準曲線,回歸線性方程為:Y=1 078.8X+0.541 2,相關系數R2為0.999 8(n=6)。結果表明,在0.10～0.21 mg質量范圍內,物質進樣量與反應時間呈現良好的線性關系。

(3)儀器精密度 精密稱取15.01 mg,置于10 mL量瓶中,加入甲醇溶解并定容。進樣體積為100 μL,重復測定6次,記錄反應時間。計算6次重復實驗的的反應時間的RSD值為0.42%,表明利用庫侖滴定法測定咖啡酸純度標準物質的檢測分析儀器精密度良好。

(4)方法精密度 按“2.2.3”項下方法配制供試品,共6份。進樣量為100 μL,記錄反應時間。計算相同重量的6份樣品的平均反應時間的RSD為0.18%,<2.0%,表明采用庫侖滴定法咖啡酸純度標準物質的檢測分析方法具有良好的精密度。

2.3均勻性檢驗 從500支咖啡酸純度標準物質最小包裝中隨機數字表法抽取15 支樣品,每支平行取樣3 次,加10%乙腈配制成500 μg·mL-1的溶液,按照“2.1.1”項下色譜條件進行均勻性檢驗,采用HPLC 面積歸一化法進行測定,獲得45個均勻性檢驗數據,結果見表1。

表1 均勻性檢驗測定結果

采用單因素方差分析對均勻性檢驗數據進行統計分析,F=1.76;查F檢驗臨界值表知:F0.05(14,30)=2.04,F

表2 方差分析結果

2.4穩定性考察

2.4.1短期穩定性考察 對包裝后標準物質樣品進行高溫實驗(60 ℃)、高濕實驗[(90±5)%,25 ℃]、光照實驗[照度(4 500±500) lx],并分別于0,7,14 d對經過高溫、高濕、光照后的標準物質樣品進行檢測,每個時間點隨機抽樣3瓶樣品,每瓶進3針,采用HPLC法檢測樣品純度,結果見表3。

表3 短期穩定性實驗結果

標準物質特性量值的標準值未知時,用平均值一致性檢驗法評價標準物質的穩定性,公式表述為:

短期實驗結果表明,經上述3種影響因素實驗前后標準物質樣品的化學純度未發生變化,包裝標準物質樣品在短期不同環境條件下的穩定性良好。

2.4.2長期穩定性 將包裝后標準物質樣品放置在常溫下長期保存,并分別于0,1,2,4,6,12個月對取樣進行純度檢測。每個時間點隨機抽樣6瓶樣品,按短期穩定性考察方法檢測樣品純度。結果見表4。

表4 長期穩定性研究數據

2.5標準值的確定

2.5.1質量平衡法 按“2.1.3”項下方法配制供試品,共10份。按上述色譜條件進行測定,記錄色譜峰面積,并計算其相對純度。檢測結果見表5和表6。采用HPLC面積歸一化法測定標準物質主成分化學純度的計算數學模型為:WHPLC=100%×A化合物色譜峰面積/A總色譜峰面積,其中WHPLC表示化合物的相對純度,A化合物色譜峰面積表示測定被測化合物色譜峰面積值,A總色譜峰面積表示測量化合物加各雜質成分的色譜峰面積之和。首先,對10 組測量純度數據進行格拉布斯(Grubbs) 檢驗以剔除可疑值,計算得G=1.585,查格拉布斯臨界值表知:G0.95(10)=2.176。因G

表5 咖啡酸主色譜峰面積結果

表6 總色譜峰面積

由表5的定值數據的化合物色譜峰面積確定咖啡酸純度標準物質主成分的純度為99.53%。鑒于高效液相色譜面積歸一化法測定純度值的局限性,根據質量平衡法原理,需要扣除樣品中在高效液相色譜檢定波長下不出峰的水分、熾灼殘渣和溶劑殘留的成分含量。分別采用干燥失重法、熾灼殘渣法、氣相色譜法測定相關物質的含量。實驗結果表明,樣品中水分含量為0.030%,熾灼殘渣為0.053%,溶劑殘留為0.004%,合計0.087%。

最終可得咖啡酸純度標準物質的純度標準值為99.53%×(100%-0.087%)=99.44%。

2.5.2庫侖滴定法 按隨機數表抽取20支標準物質樣品,采用甲乙雙人獨立操作,精密稱取約15.00 mg,置于10 mL量瓶中,使用甲醇定容,待用。利用體積計算含咖啡酸樣品量,采用100 μL進樣量進行實驗,記錄反應時間。庫侖滴定法的數學模型為:x=(W/W樣)×100% =[(Q×M)/(n×F)/(mV1/V2)]×100% =[(i×t×M)/(n×F)/(mV1/V2)]×rep×100%,式中W表示反應物質的量 (g);W樣表示反應樣品進樣量 (g);V1表示實驗進樣量體積 (μL);V2表示容量瓶體積 (μL);Q表示通過電極的電量(C);i表示電流(A);t表示時間(s);M表示反應物質分子量;n表示電子數;F表示法拉第常數 (96 486.57庫侖/當量),測定結果見表7。對得到的20組咖啡酸化學純度標準物質純度值采用格拉布斯檢驗進行可疑值的剔除,經計算得G甲=1.576,G乙=1.504。查格拉布斯臨界值表知:G0.95(10)=2.176。因G值均小于G0.95(10),故無可疑值存在。2次獨立檢測數據的t檢驗結果為0.12,小于臨界值2.10,表明兩次獨立檢測數據無顯著性差異。

表7 咖啡酸化學純度標準物質的庫侖滴定定值檢測結果

庫侖滴定法確定的咖啡酸標準物質的化學純度標準值為99.531%。

表8 咖啡酸純度標準物質兩種原理方法定值結果

2.6不確定度評定

2.6.1定值引入的不確定度定度分量分別為:u(A主色譜峰)=3.344 1;u(A總色譜峰)=3.501 8。

由“5.1”項下測定結果可知,咖啡酸化學純度標準物質中的水分、無機雜質與溶劑殘留的含量測定值均小于 0.1%,對定值結果影響較小,故由其引入的不確定度可以忽略不計。

計算質量平衡法測量的合成不確定度0.002 93。

(2)庫侖滴定法定值測量引入的不確定度 由純度計算數學模型可知,庫侖滴定法引入的不確定度評定分量見表9。

表9 庫侖滴定法的合成標準不確定度評定分量

根據表7數據計算獲得由庫侖法試驗引入的各種不確定度分量值,詳細結果見表9中相對標準不確定度列數據。計算庫侖滴定法測量的合成不確定度1.83×10-3。

由表1計算獲得樣品均勻性引入不確定度值為2.23 ×10-9,因均勻性產生的不確定度較小,可以忽略。

2.6.3樣品穩定性引入不確定度 根據樣品長期穩定性考察數學模型,斜率的不確定度為:

由表4計算獲得樣品穩定性引入的不確定度值St=12×Sa=3.348×10-5,由此值可知,因長期穩定性產生的不確定度較小,可以忽略。

2.6.4合成不確定度計算

故總合成不確定度僅由定值方法不確定度引入,計算獲得總合成不確定度值為3.45×10-3。

2.6.5擴展不確定度計算 數學模型為U=kuc(總),式中U表示擴展不確定度;k表示包含因子;uc(總) 表示總合成不確定度。k取 2,置信水平P為95%,計算擴展不確定度值為0.69%。

2.7定值結果及不確定度表示 咖啡酸純度標準物質的純度值為(99.5±0.7)%,k=2,P=0.95。

3 討論

論文首次采用2 種質量平衡法和庫侖滴定法不同原理技術方法對咖啡酸純度標準物質進行聯合定值研究,有效克服了僅采用單一原理技術方法定值帶來的分析方法缺陷和不足,使純度標準物質定值結果更加準確可靠,為藥品相關純度標準物質的研制提供了技術方法參考。

本文研制的咖啡酸純度標準物質具有準確的純度標準值和不確定度,在國內外屬首次研制,并已經獲得國家質量監督檢驗檢疫總局批準為國家一級計量有證標準物質,證書編號為GBW09529。該標準物質具備量值溯源和傳遞功能,不僅可用于相關中藥材、中成藥、提取物、藥物中間體等產品的質量控制,還可用于儀器校準、新方法確認等研究,具有非常廣泛的實際應用價值。