基于網絡藥理學探究當歸芍藥散入血成分治療原發性痛經的有效性及機制*

趙藍青青,李哲,劉孜,李娜,李忠思,劉振華,熊輝

(1.承德醫學院河北省中藥研究與開發重點實驗室,承德 067000;2.承德醫學院省神經損傷與修復重點實驗室,承德 067000;3.承德醫學院基礎醫學研究所,承德 067000;4.承德醫學院附屬醫院藥學部,承德 067000)

當歸芍藥散最早見于《金匱要略》,由川芎、當歸、澤瀉、白術、芍藥、茯苓六味中藥組成[1],是中醫臨床治療痛經的經典名方。其藥理作用主要有改善內分泌、抑制炎癥、調節平滑肌等,臨床中多用于治療原發性痛經、慢性盆腔炎、老年癡呆癥、腎病綜合征等疾病[2]。諸多臨床應用表明,當歸芍藥散治療痛經的療效明顯優于布洛芬[3]、去氧孕烯炔雌醇[4]、阿司匹林[5]等西藥,且安全性高,未發現有明顯的毒副反應。當歸芍藥散作為多成分、多靶點共同發揮作用的中藥復方,治療原發性痛經的藥效物質及作用機制尚不完全明確。文獻[6-8]對當歸芍藥散進行了入血成分研究,發現茯苓酸、Z/E-丁烯基酞內酯、澤瀉醇B、藁本內酯、澤瀉醇A、洋川芎內酯A、洋川芎內酯I、芍藥內酯苷、芍藥苷、阿魏酸及其代謝產物12個主要血中移行成分,為當歸芍藥散的作用機制研究奠定了物質基礎。

中藥血清藥物化學研究表明,口服藥物發揮藥理作用必須依賴于進入血液循環的藥效物質[9],因此,以入血成分詮釋作用機制,得出的結果更加客觀、嚴謹。本研究針對篩選出的當歸芍藥散12個入血成分,借助網絡藥理學與分子對接技術,探究當歸芍藥散治療原發性痛經的可能機制,并驗證當歸芍藥散的有效性。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1當歸芍藥散入血成分及潛在作用靶點篩選 在中國知網及PubMed數據庫進行2012—2022年當歸芍藥散組方入血成分的檢索。在PharmGkb、TTD及SwissTargetPrediction平臺查找其潛在作用靶標。

1.1.2原發性痛經相關基因靶點篩選 采用OMIM(http://www.omim.org/)數據庫、GeneCards(https://www.genecards.org/)數據庫篩選并確定原發性痛經的相關基因靶點,關鍵詞為“Primary Dysmenorrhea”。

1.1.3實驗動物 SPF級雌性SD大鼠40只,體質量(200±20) g,購于北京華阜康生物科技股份有限公司,動物生產合格證號:SCXK(京)2019-0008。大鼠適應環境1周。所有實驗按照承德醫學院實驗動物中心福利和倫理原則操作。

1.1.4材料與設備 當歸飲片(批號:C25292012008)、川芎飲片(批號:C2472012004)、澤瀉飲片(批號:C386-20212002)、白術飲片(批號:C2242012003)、白芍飲片(批號:C2232012004)、茯苓飲片(批號:C045210-4001),均購于河北蓮花池藥業有限公司,由承德醫學院中藥研究所趙春穎教授鑒定為正品。苯甲酸雌二醇注射液(4 mg·L-1,批號:210214);縮宮素注射液(10 U·mL-1,批號:210201),均購于上海全宇生物科技動物藥業有限公司。布洛芬片(赤峰蒙欣藥業有限公司,批號:2102019)。HZT-A1000型電子天平(美國康州電子秤科技有限公司,感量:0.01 g)、星海旋轉蒸發器(無錫市星海生化設備有限公司)、SOIENTZ-18N型冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2方法

1.2.1入血成分-靶點網絡構建 利用R語言得到12種入血成分及篩選所得的原發性痛經疾病靶點的交集基因,通過Cytoscape3.6.1版軟件完成入血成分-靶點網絡構建,進行拓撲學分析。

1.2.2靶點生物過程與代謝通路分析 利用DAVID數據庫研究基因本體(Gene Ontology,GO)生物學過程和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and gnomes,KEGG)信號通路分析,預測其治療原發性痛經的主要機制,并將P值排序前二十的結果做氣泡圖進行可視化。

1.2.3分子對接 利用篩選出的復方關鍵成分和核心靶蛋白,采用AutoDock Vina 1.2.3版軟件進行分子對接,最后將結合活性較強的結果利用PyMOL 2.4版軟件繪制三維圖進行可視化展示。

1.2.4動物實驗評價當歸芍藥散治療原發性痛經的有效性

①藥物制備 當歸芍藥散灌胃液:稱取飲片當歸3 g、川芎8 g、澤瀉8 g、茯苓4 g、白術4 g、芍藥16 g,粉碎至50目篩,置于1000 mL圓底燒瓶加入10倍量50%乙醇浸泡60 min,加熱回流2 h,藥液經濾紙濾過;加入8倍量50%乙醇加熱回流1.5 h。合并2次濾液,再次過濾,減壓濃縮至無醇味,-40 ℃預凍后用冷凍干燥法制成疏松粉末,即當歸芍藥散凍干粉,以蒸餾水配置成濃度為0.33 g·mL-1的混懸液備用。布洛芬灌胃液:布洛芬片研至粉末狀,以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配置成濃度為0.005 4 g·mL-1的混懸液備用。

②原發性痛經模型的復制 40只SD雌性大鼠按照隨機數字表法分為對照組、原發性痛經模型組、陽性藥組和當歸芍藥散組4組,每組10只。

造模方法參考文獻[10],模型組、陽性藥組與當歸芍藥散組皮下注射苯甲酸雌二醇10 d(第1、第10天,1 mg·kg-1;第2—9 天,0.5 mg·kg-1),第10天給藥30 min后,給予縮宮素25 U·mL-1腹腔注射,對照組注射同等劑量的0.9%氯化鈉溶液。造模后大鼠出現扭體反應且次數顯著增多,即為模型復制成功。當歸芍藥散組以劑量10 mL·kg-1灌胃當歸芍藥散混懸液10 d,每天1次;陽性藥組以劑量10 mL·kg-1灌胃布洛芬混懸液10 d,每天1次;對照組及模型組灌胃給予純化水。末次給藥60 min后,各組大鼠充分麻醉暴露腹腔,收集子宮組織,以10%甲醛溶液固定。

③當歸芍藥散有效性評價 觀察并記錄各組大鼠注射縮宮素后30 min內的扭體次數。造模及給藥期間對各組大鼠進行體質量監測,并觀察一般體征。

子宮組織置于10%甲醛溶液固定24 h以上,石蠟包埋,切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,進行鏡檢觀察。

1.2.5統計學分析 采用SPSS 25.0版軟件進行數據分析,多組比較采用單因素方差分析,以GraphPad Prism 8.0作圖,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1入血成分與原發性痛經靶點收集 當歸芍藥散中入血成分12個[6-8],其中當歸中5個,川芎中7個,白芍中2個,澤瀉中2個,茯苓中1個,白術中未發現入血成分,入血成分靶點296個,入血成分信息見表1。以“Primary Dysmenorrhea”為關鍵詞,從OMIM及GeneCards數據庫篩選出疾病靶點共517個,取交集得到入血成分與原發性痛經的靶點26個,見圖1。

圖1 藥物與疾病的交集基因

表1 入血成分的基本信息

2.2入血成分-原發性痛經靶點網絡 運用Cytoscape3.6.1版軟件,以入血成分與疾病靶點構建“當歸芍藥散入血成分-疾病靶點網絡”,可視化分析得531個節點,577條邊,連線表示入血成分與疾病靶點之間的相互作用,見圖2。

藍色橢圓形代表入血成分;黃色方形代表入血成分與疾病交集靶點;紫色菱形代表疾病基因。

2.3PPI網絡 通過STRING網站對共同靶點進行蛋白互作網絡(PPI)分析,見圖3,利用Cytoscape3.6.1版軟件對數據進行可視化分析,度值越大,節點的顏色越深、圖形越大;兩點間連線越粗,節點間相互作用越強。其中核心靶點有VEGFA、腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素(interleukin,IL)-6、ESR1、PTGS2等。

圖3 蛋白-蛋白互作網絡

2.4GO和KEGG通路富集分析 GO富集分析得1603個富集條目(P<0.05),其中生物過程主要富集在調節炎癥反應、調控細胞因子、調節內皮屏障、參與類固醇激素代謝、增強配體-受體活性、調節應答神經應激反應等方面,排名前十的富集結果見圖4。篩選出68條信號通路(P<0.05),主要涉及IL-17、腫瘤壞死因子、MAPK、花生四烯酸代謝、雌激素等信號通路。KEGG分析排名前二十的條目見圖5,所得氣泡圖中圖形越大、顏色越綠,說明P值越小,富集越顯著。

圖4 GO富集分析

圖5 KEGG 信號通路(前20條)富集分析

2.5分子對接 將入血成分-疾病網絡篩出的關鍵成分與度值排名靠前的靶蛋白分子對接,結果顯示結合能均為負值,數值越小表明二者之間親和力越高,見表2?？梢暬治霭l現,Z-丁烯基酞內酯、芍藥內酯苷、洋川芎內酯I三個關鍵成分與各蛋白結合能力較強,各成分均與PTGS2結合能力最強,見圖6。

圖6 關鍵成分與核心靶點蛋白PTGS2對接

表2 關鍵成分與核心靶點的分子對接評分表

2.6當歸芍藥散有效性評價 注射縮宮素后30 min內模型組、陽性藥組及當歸芍藥散組的扭體次數均顯著高于對照組(0次)(P<0.01),模型復制成功;當歸芍藥散組及陽性藥組扭體次數分別為(10.67±6.54)和(11.50±7.81)次,均顯著少于模型組(27.8±11.19)次(P<0.01)。造模給藥的10 d內模型組體質量較對照組增長緩慢,差異有統計學意義(P<0.01),給藥結束后當歸芍藥散組與模型組間體質量差異有統計學意義(P<0.05),見圖7-A及圖7-B。組織病理學分析,模型組較對照組出現嚴重子宮內膜剝脫及水腫;當歸芍藥散組及陽性藥組較模型組子宮內膜剝脫及水腫程度明顯減輕,見圖8。綜上,當歸芍藥散可改善由苯甲酸雌二醇聯合縮宮素誘導的原發性痛經模型大鼠痛經反應。

①與對照組比較,P<0.01;②與模型組比較,P<0.05。

圖8 4組大鼠子宮組織病理變化(×200)

3 討論

原發性痛經(primary dysmenorrhea,PD)是生殖器官無器質性病變引起的痛經,主要癥狀包括下腹部痙攣性疼痛,伴有惡心、嘔吐、腹瀉、頭暈等表現[11]。西醫認為PD的病因可能與前列腺素、縮宮素、血管加壓素、神經遞質、遺傳及心理等多種因素關系密切[12],常用治療藥物有解熱鎮痛類、激素類及非甾體抗炎藥物,雖然療效確切,但是易引起眩暈、頭痛、胃腸道不良反應及產生耐藥性[13]。當歸芍藥散作為中醫治療痛經的經典名方,已被制成顆粒劑廣泛用于脾虛、肝郁、血虛等痛經的治療。經動物實驗驗證,當歸芍藥散可顯著減少PD模型大鼠的扭體次數和改善大鼠子宮內膜剝脫及水腫情況,為臨床應用有效性提供佐證,當歸芍藥散的潛在作用機制值得深入研究。

本研究明確了當歸芍藥散12個入血成分治療原發性痛經的26個關鍵靶點,通過分子對接篩選出洋川芎內酯I、Z-丁烯基酞內酯、芍芍藥內酯苷3個與PD關鍵靶點結合較強的入血成分,可初步認為是當歸芍藥散治療PD的藥效物質基礎。3種活性成分可通過下調炎癥因子表達水平、誘導細胞凋亡、抑制細胞的周期性進程等方式發揮抗炎、抗氧化應激及保護血管等多重藥理作用[14-16]。關鍵靶點TNF可誘導炎癥反應和誘導細胞凋亡,對B細胞、T細胞、樹突細胞的發育有突出作用[17];IL-6對子宮有收縮作用,誘導炎癥反應,進而導致子宮上皮局部組織缺血缺氧引發痛經[18];VEGFA促進內皮細胞生長,擴張血管,增加血管通透性[19];ESR1刺激血清中肥大細胞釋放疼痛物質而產生痛經[20];PTGS2促進前列腺素的合成,造成平滑肌痙攣性收縮導致痛經[21]。

KEGG通路主要富集在IL-17、TNF、MAPK、花生四烯酸代謝、雌激素、卵巢類固醇生成等信號通路,關鍵靶點中的TNF、IL-6、IL-1β、PTGS2等均在IL-17信號通路及TNF信號通路上有所富集。IL-17通路可抑制炎癥因子、趨化因子的產生,緩解炎癥,文獻中缺乏IL-17基因的小鼠對各種病原菌的易感性顯著增高,死亡風險增加[22-23]。TNF-α作為腫瘤壞死因子的一種亞型,促進IL-1、IL-6和IL-8等炎癥介質的釋放,參與炎癥反應的調控[24]。MAPK信號通路[25-26]與炎癥、腫瘤等疾病關系密切,MAP激酶對多種炎癥細胞因子的表達起調節作用。綜上,當歸芍藥散對原發性痛經的治療作用,主要通過作用于關鍵靶點,調控激素效應、調節炎癥因子的表達,抑制子宮的炎癥反應來實現。

本研究基于當歸芍藥散的入血成分,通過網絡藥理學、分子對接技術及動物實驗三種策略,分析其治療原發性痛經的作用靶點、生物過程、信號通路及有效性,為今后全面認識當歸芍藥散的藥理作用及臨床價值提供思路與線索。