川芎嗪-延胡索乙素凝膠貼膏的制備及評價

黃慧敏,陳惠嫻,鐘玉環(huán),宋煜*,吳水生*

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州 350122;2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,福建 福州 350122)

多味中藥配伍使得中藥方劑具有多組分、多靶點等綜合優(yōu)勢,但同時也導(dǎo)致其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及配伍機制的研究龐雜[1]。組分中藥是以傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論為指導(dǎo),遵循方劑配伍原則,由有效組分配伍而成的現(xiàn)代中藥,是將中藥引入現(xiàn)代藥物制劑方法和技術(shù)的一種新手段[2]。組分配伍的建立與完善,可將中藥配伍復(fù)雜的體系簡單化,可促進組分中藥制劑向更為有效、安全、質(zhì)量可控的方向發(fā)展[3]。本課題以經(jīng)典藥對“川芎-延胡索”的主要成分為研究對象[4-5],其中,川芎能夠活血行氣、祛風(fēng)止痛;延胡索具有行氣、活血、止痛之效;二者相須為用,使活血止痛之效更佳。因此,本試驗以組分配伍為指導(dǎo)思想,從單體成分相互作用層面出發(fā),選取川芎中的川芎嗪、延胡索中的延胡索乙素進行制劑研發(fā)。

由現(xiàn)代藥理學(xué)研究可知,川芎嗪對炎性疼痛、心絞痛、神經(jīng)性疼痛等具有較好的療效[6],但其口服制劑、注射劑等雖在體內(nèi)吸收迅速,但半衰期較短,無法持續(xù)在體內(nèi)釋放[7];延胡索乙素具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、神經(jīng)保護等多種藥理活性,但其在體內(nèi)穩(wěn)定性較差[8],且不易溶于水[9],故將其二者制成凝膠貼膏。凝膠貼膏具有避免首過效應(yīng)、控制藥物釋放率、與皮膚相容性好等優(yōu)點[10]。本研究以初黏力、模擬汗液影響、感官評價的綜合評分為指標(biāo),采用Plackett-Burman 設(shè)計、最陡爬坡試驗、Central Composite Design 響應(yīng)面法優(yōu)化凝膠貼膏的基質(zhì)處方,同時篩選其最佳促滲劑種類及用量,制備川芎嗪-延胡索乙素凝膠貼膏,為該劑型后續(xù)開發(fā)使用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20AT型高效液相色譜儀(日本島津公司);RYJ-12B藥物透皮擴散試驗儀(上海黃海藥檢儀器有限公司);DV215CD型十萬分之一天平(美國OHAUS公司)。

1.2 試藥 聚丙烯酸鈉(NP-700,昭和電工株式會社,批號:240770A);甘羥鋁(日本協(xié)和工業(yè)株式會社,批號:SG-0557);聚乙烯醇(PVA1788,批號:H1809081);卡波姆940(羅恩試劑公司,批號:R005294);羧甲基纖維素鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司,批號:20151215);無水檸檬酸(阿拉丁生化科技有限公司,批號:K2110834);甘油(麥克林生化科技有限公司,批號:C11455088);氮酮(源葉生物,批號:J21GS152202);桉葉油(源葉生物,批號:B09N10C102404);丙二醇(麥克林生化科技有限公司,批號:C12517049);Transcutol P(麥克林生化科技有限公司,批號:C10606031)。川芎嗪、延胡索乙素(湖北帝柏公司,純度≥98%)。

2 方法與結(jié)果

2.1 凝膠貼膏制備 A相:取處方量NP-700、CMC-Na、甘油混合;B相:取處方量卡波姆940、PVA在水中溶脹;C相:取處方量甘羥鋁、無水檸檬酸加水溶解;D相:組方藥物加乙醇溶解;先將B、C、D相混勻后,加入A相,同時加入促滲劑,攪拌均勻后立即涂布在7 cm×40 cm無紡布上,覆膜晾干后,裁成7 cm×10 cm大小即得。

2.2 評價指標(biāo)建立

2.2.1 初黏力 根據(jù)滾球斜坡停止法[11],取“2.1”項下7 cm×10 cm大小的凝膠貼膏1片,揭開防黏層后膏面向上,固定于30°斜面上,取不同直徑的鋼球,從膏面自由滑落,測試3次,能粘住最大鋼球直徑為滿分,其余以(粘住鋼球直徑測得值/最大鋼球直徑)×30計分。

2.2.2 模擬汗液 由于凝膠貼膏在體應(yīng)用會接觸到體溫與汗液,尤以使用烤燈促進藥物吸收時,易導(dǎo)致膏劑出現(xiàn)變黏、拉絲、滯留皮膚等現(xiàn)象。因此本研究特設(shè)模擬人體溫度及汗液對膏體的影響作為考察因素。將凝膠貼膏撕開防黏層貼在光滑的不銹鋼鋼面上,加入1 mL的生理鹽水,置于45 ℃烘箱,并于每貼背襯上壓重物,12 h后撕開進行評分,以20分為基準(zhǔn);不拉絲,不黏膩,不殘留在鋼板上為15～20分,拉絲、黏膩,但不殘留在鋼面上為9～14分,拉絲、黏膩且殘留在鋼面上0～9分。

2.2.3 感官評價 參考文獻(xiàn)[12-13],指標(biāo)包括①外觀,膏體均勻,氣泡少為10分,以2分為一級,依次按0～10分計分;②殘留情況,揭開覆膜無拉絲,手指輕觸表面無殘留為10分,2分為一級,依次按0～10分計分;③涂布性,根據(jù)涂布的難易程度分為5個等級,2分為一級,依次按0～10分計分;④滲布情況,根據(jù)無紡布滲出的輕重程度為5個等級,2分為一級,依次按0～10分計分;⑤皮膚追隨性,將凝膠貼膏貼于手臂用力甩動,依據(jù)膏體甩動掉落的次數(shù)排序,由大到小按0～10分計分。

2.3 Plackett-Burman設(shè)計 根據(jù)臨床用量結(jié)合單體成分在飲片中的含量,往每個處方中固定加入川芎嗪320 mg、延胡索乙素128 mg,采用Plackett-Burman 設(shè)計對其他因素進行安排,以“2.2”項下綜合評分為指標(biāo),因素水平見表1,結(jié)果見表2。

表1 Plackett-Burman設(shè)計因素水平

表2 Plackett-Burman設(shè)計結(jié)果

通過Design-Expert 8.0.6軟件對表2數(shù)據(jù)進行擬合,得到回歸方程為綜合評分=55.29+2.94A+4.25B+6.39C+7.92D-3.82E+2.77F-1.70G(r=0.939 1)。方差分析見表3,表明模型具有顯著性(P<0.05);各因素影響程度依次為:D>C>B>E>A>F>G,其中NP-700、CMC-Na 用量有顯著影響(P<0.05)。

表3 Plackett-Burman設(shè)計方差分析

2.4 最陡爬坡試驗 通過最陡爬坡試驗來進一步確定凝膠貼膏的處方水平范圍。結(jié)果見表4,試驗號4綜合評分最高,故Central Composite Design 響應(yīng)面法選擇其作為因素中心點。

表4 最陡爬坡試驗結(jié)果

2.5 Central Composite Design 響應(yīng)面法 以“2.3”和“2.4”項下試驗數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),進一步采用Central Composite Design 響應(yīng)面法進行優(yōu)化,因素水平見表5,結(jié)果見表6。

表5 Central Composite Design 響應(yīng)面法因素水平

表6 Central Composite Design 響應(yīng)面法結(jié)果

通過Design-Expert 8.0.6軟件對表6數(shù)據(jù)進行擬合,得到回歸方程為綜合評分=79.17+3.24A+3.23B+4.29AB-8.71A2-6.64B2+1.27A2B-7.45AB2(r= 0.978 3),方差分析見表7,模型顯著(P=0.000 7),失擬項P=0.601 2>0.05,可用于預(yù)測;因素A、B、AB、A2、B2、AB2均為顯著項(P<0.05)。響應(yīng)面分析見圖1,最終確定最加基質(zhì)處方NP-700用量為14.00 g,CMC-Na用量0.4 g,綜合評分為79.17。

圖1 響應(yīng)面圖

表7 Central Composite Design 響應(yīng)面法方差分析

2.6 驗證試驗 按最佳處方制備3批凝膠貼膏,進行驗證試驗。所得凝膠貼膏綜合評分的平均值為79.33分,RSD為0.7278%,與預(yù)測值79.17分接近,表明該方法穩(wěn)定可靠,預(yù)測性良好。

2.7 川芎嗪、延胡索乙素含量測定HPLC方法建立

2.7.1 色譜條件 色譜柱:SinoChrom ODS-BP(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:乙腈(A)-0.1%甲酸水(B);梯度洗脫(0～3 min,10% A;3～6 min,10% A→20% A;6～15 min,20% A→51% A;15～18 min,51% A→60% A;18～24 min,60% A→90% A;24～28 min,90% A→10% A;28～30 min,10% A);流速:1.0 mL·min-1;檢測波長:280 nm;柱溫:35 ℃;進樣量:20 μL。

2.7.2 制備混合對照品溶液 精密稱取川芎嗪2.02 mg、延胡索乙素2.05 mg,分別置于5 mL量瓶中,用甲醇配制成0.404 mg·mL-1、0.410 mg·mL-1的母液;再吸取各樣品母液2.5 mL于25 mL同一量瓶中,用20%甲醇定容至刻度,得川芎嗪濃度為40.4 μg·mL-1、延胡索乙素濃度為41.0 μg·mL-1混合對照品溶液。

2.7.3 制備供試品溶液 取經(jīng)皮滲透藥物溶液,經(jīng)0.22 μm濾膜濾過,即得。

2.7.4 制備陰性樣品溶液 取空白凝膠貼膏接收液,經(jīng)0.22 μm濾膜濾過,即得。

2.7.5 專屬性試驗 將對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液按照“2.7.1”色譜條件下測定,見圖2。結(jié)果顯示此方法對兩待測成分含量測定無干擾,專屬性良好。

2.7.6 線性與范圍 取“2.7.2”項下混合對照品溶液0.1、0.5、1、2.5、5、7.5 mL,置于10 mL容量瓶中,用20%甲醇稀釋并定容至刻度,搖勻。取上述系列稀釋溶液及混合對照品溶液,按“2.7.1”項下色譜條件測定,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進行回歸,得回歸方程分別為川芎嗪Y=37 457X+5 457.8,r=0.999 6;延胡索乙素Y=16 095X+5 553.1,r=0.999 3。結(jié)果表明,川芎嗪在0.404～40.0 μg·mL-1、延胡索乙素在0.401～40.1 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7.7 溶液穩(wěn)定性試驗 取“2.7.3”項下供試品溶液,在“2.7.1”項色譜條件下于0、1、2、4、8、10、12和24 h進樣測定,測得川芎嗪、延胡索乙素峰面積RSD分別為2.33%、1.83%,表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.8 精密度試驗 取“2.7.2”項下對照品溶液,按“2.7.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次。測得川芎嗪、延胡索乙素峰面積的RSD分別為1.09%、0.81%,表明儀器精密度良好。

2.7.9 回收率試驗 在“2.7.4”項下的陰性樣品溶液中分別加入混合對照品溶液,制成到高、中、低濃度后,按“2.7.1”項下色譜條件分別進樣測定,測得川芎嗪、延胡索乙素平均回收率分別為99.06%、100.19%,RSD分別為0.62%、3.34%。

2.8 體外經(jīng)皮滲透試驗

2.8.1 離體皮膚的制備 將SD大鼠用20%烏拉坦(0.7 mL每100 g)麻醉后,用電動剃毛刀去除大鼠背部體毛,脫毛膏涂布皮膚2 min后用棉球擦去,處死,剝離背部皮膚并剔除皮下組織和脂肪等粘連物質(zhì),用生理鹽水干凈后,置-80 ℃冰箱中保存。

2.8.2 擴散試驗 采用Franz擴散池法,將貼有凝膠貼膏的皮膚置于擴散池上、下兩室間,向接受室中加滿含30%乙醇的生理鹽水溶液,確保供給室中的溶液不漏出后,用洗耳球輕敲以排氣泡。設(shè)置恒溫水浴溫度為32 ℃,磁力攪拌速度為300 r·min-1。擴散面積為2.269 cm2,接受室體積為6.5 mL,開始計時,分別于2、4、6、8、12、24 h取樣1 mL,同時補充相同條件下的補給液1 mL。將取出的接收液按照“2.7.1”中的色譜條件進行測定,并計算樣品濃度。

2.8.4 促滲劑選擇 根據(jù)前期文獻(xiàn)調(diào)研,選擇3%氮酮、氮酮+丙二醇=1∶1、桉葉油、transcutol P作為促滲劑種類進行篩選,經(jīng)皮滲透曲線見圖3。由表8～9可知,氮酮較其他促滲劑而言對川芎嗪和延胡索乙素都具有較好的促滲作用。因此以氮酮作為促滲劑,進一步篩選其用量。

圖3 不同促滲劑對川芎嗪(A)、延胡索乙素(B)累計滲透量的影響(n=3)

表8 不同促滲劑對川芎嗪體外經(jīng)皮滲透的影響(n=3)

表9 不同促滲劑對延胡索乙素體外經(jīng)皮滲透的影響(n=3)

2.8.5 氮酮質(zhì)量濃度分?jǐn)?shù)選擇 不同質(zhì)量濃度分?jǐn)?shù)氮酮的經(jīng)皮滲透曲線見圖4,對川芎嗪、延胡索乙素滲透特征的影響見表10～11。由表可知,通過促滲率比較,不同質(zhì)量濃度分?jǐn)?shù)氮酮對川芎嗪促滲作用大小為3%>5%>1%>2%>7%,對延胡索乙素為5%>3%>2%>1%>7%。結(jié)果表明,3%氮酮對川芎嗪的促滲效果最好,5%氮酮對延胡索乙素的促滲效果最好,且氮酮的促滲效果與其質(zhì)量濃度分?jǐn)?shù)呈非線性關(guān)系。由于3%與5%氮酮濃度對川芎嗪、延胡索乙素的經(jīng)皮滲透速率差異不大,且24 h平均累計滲透量,均無顯著性差異。因此,為降低促滲劑對膏體質(zhì)量產(chǎn)生的影響,同時減少氮酮對皮膚刺激性,最終選擇以3%氮酮作為促滲劑。

圖4 不同質(zhì)量濃度分?jǐn)?shù)氮酮對川芎嗪(A)、延胡索乙素(B)累計滲透量的影響(n=3)

表10 不同質(zhì)量濃度分?jǐn)?shù)氮酮對川芎嗪體外經(jīng)皮滲透的影響(n=3)

表11 不同質(zhì)量濃度分?jǐn)?shù)氮酮對延胡索乙素體外經(jīng)皮滲透的影響(n=3)

3 討論

通過預(yù)試驗對評分指標(biāo)進行考察,按現(xiàn)行國家藥典要求還需要對貼劑進行持黏力與剝離強度的測定,但由于本試驗這兩個測定結(jié)果的差異性不大,故未作為正式試驗的評分指標(biāo)。選擇模擬汗液影響作為評分指標(biāo),是在預(yù)試驗中將凝膠貼膏貼于后背過夜,由于汗液和人體自身重量產(chǎn)生的壓力與溫度,使得貼膏變黏膩且殘留在皮膚上,因此本研究特設(shè)模擬汗液影響作為評分標(biāo)準(zhǔn)對貼劑基質(zhì)處方進行篩選。由于促滲劑的使用會對貼劑的性質(zhì)產(chǎn)生一定影響,因此本試驗在篩選空白基質(zhì)時固定加入3%氮酮進行評價。同時,在前期試驗中對膏體的厚度進行一定的篩選,選擇以0.5、1、1.5和2 mm的厚度,經(jīng)過模擬汗液影響的試驗后,發(fā)現(xiàn)厚度為1 mm時膏體不易產(chǎn)生拉絲殘留的現(xiàn)象且在感官評價中的評分較高,因此將膏體的涂布厚度設(shè)定為1 mm。

通常在透皮實驗中為模擬人體內(nèi)的釋放環(huán)境而選擇用生理鹽水為接收介質(zhì)[14],但由于延胡索乙素的水溶性較差,為滿足漏槽條件,本研究選擇使用30%乙醇-生理鹽水溶液作為接收液介質(zhì)。同時,通過透皮擴散實驗可知,促滲劑用量與促滲效果并不是成正比的關(guān)系,因此以多成分指標(biāo)篩選促滲劑用量時,應(yīng)綜合考慮膏體對促滲劑的容納度,促滲劑對膏體殘留情況的影響以及各成分發(fā)揮的作用,尤其以中藥復(fù)方提取物為原料藥時,可考慮從君臣佐使的角度進行權(quán)重分析,同時兼顧各成分的滲透速率、促滲率、累計滲透量、相關(guān)系數(shù)等[15]。根據(jù)沈騰等[16]研究,當(dāng)川芎嗪透皮給藥制劑面積為70 cm2時,透皮速率須到29.33 μg·(cm2·h)-1以上可達(dá)到治療血藥濃度,本試驗以3%氮酮作為促滲劑時透皮速率為42.827 μg·(cm2·h)-1可滿足其治療要求,同時與延胡索乙素配伍使用,使其效果更佳。

中藥復(fù)方體系的療效是藥物中的單體化合物共同協(xié)調(diào)發(fā)揮多靶點作用的結(jié)果[17]。因此,我們以“從復(fù)方中來到復(fù)方中去”為思路[18],從“川芎-延胡索”藥對的諸多化合物中選擇出單一的有效化合物成分,以川芎嗪、延胡索乙素為組分配伍制備凝膠貼膏。試驗所制得凝膠貼膏具有明確的有效成分,制備簡便,質(zhì)量可控,為組分配伍所制中藥劑型提供了現(xiàn)實意義和理論意義。