5-氮雜-2’-脫氧胞苷對苯并[a]芘致海馬神經元毒性的保護作用

魏智超 馮婧宇 聶繼盛 魏建宏

1.山西醫科大學公共衛生學院，山西太原 030000；2.山西醫科大學汾陽學院，山西汾陽 032200

表觀遺傳學是指當核苷酸序列不變時，基因表型改變的一門學科。DNA 甲基化是最重要的基因修飾途徑，是人類生命過程中的重要組成部分[1-2]，它可以調節神經元發育中的重要過程[3-5]。哺乳動物細胞中DNMT1、DNMT3A 和DNMT3B 3 種酶具有DNA 甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）活性[4]。

苯并[a]芘（benzo[a]pyrene，B[a]P）是多環芳烴的主要代表，在香煙煙霧、柴油廢氣及工業廢物中可以檢測到高濃度的B[a]P[6]。B[a]P 具有遺傳毒性、致畸性和神經毒性等特點。由于其親脂性，B[a]P 能輕易通過血腦屏障，可導致認知功能障礙、神經功能損傷[7-9]。B[a]P 暴露后DNA 甲基化的變化可影響肺癌發展[10]。B[a]P 可引起精子DNA 異常甲基化，與胚胎、生殖系統發育和許多遺傳疾病有關[11]，還可影響小鼠血液和肝臟中的DNA 甲基化水平[12]。但是，目前關于DNA 甲基化在B[a]P 致神經毒性中的作用研究較少。

5-氮雜-2’-脫氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-cdR）為DNA 甲基轉移酶抑制劑[13]。研究發現5-Aza-cdR 可以通過氧化應激來調節百草枯對PC12 細胞的毒性作用[14]。目前，5-Aza-cdR 對B[a]P所致的神經毒性作用尚未見報道。本研究旨在構建B[a]P 的體外染毒模型，利用5-Aza-cdR 進行干預，探討5-Aza-cdR 對B[a]P 神經毒性的保護作用，為深入探索B[a]P 的發病機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3 月齡SPF 級SD 大鼠20 只[山西醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（晉）2019-0004），合格證號：SYXK（晉）2019-0007]。體重250～300 g，雌雄比例2∶1 合籠交配。飼養條件：溫度（24±2）℃，濕度（55±5）%。本研究經山西醫科大學汾陽學院動物倫理委員會審批通過（2018-021）。

1.2 實驗材料

B[a]P（B1760，sigma）；5-Aza-cdR（D9010，索萊寶）；無血清培養基（21103049，Thermo）；β-tubulinⅢ抗體（AB0043，abways）；兔抗DNMT1 抗體（YN2950，Immunoway）；兔抗DNMT3A 抗體（20954-1-AP，武漢三鷹生物技術有限公司）；兔抗 DNMT3B 抗體（26971-1-AP，武漢三鷹生物技術有限公司）；實時熒光定量試劑盒[FP215，天根生化科技（北京）有限公司]；凝膠成像分析儀（731BR03 442，Bio-Rad）；定量反轉錄PCR 儀（CFX96，Bio-Rad）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養 雌鼠妊娠21 d 后，取24 h 內新生SD大鼠10 只，斷頭，收集海馬組織于15 ml 離心管，添加DMEM 培養基，2 mg/ml 的木瓜酶37℃消化30 min，添加胎牛血清終止消化，去上清，加入10 μl DNA 酶，槍頭吹打10 次，移液槍吸取上清于新離心管，200 目篩過濾細胞懸液，重復3 次。離心機1 500 r/min 離心5 min（離心半徑9 cm），去上清，加入培養基重懸，進行細胞計數。以7×105個/ml 的接種密度均勻鋪板，每孔體積2 ml，37℃培養箱培養。6 h 后更換無血清培養基，每隔2 d 半量換液。光鏡觀察細胞形態。

1.3.2 免疫熒光法鑒定海馬神經元 海馬神經元培養至第5 天，4%多聚甲醛固定1 h。加入0.1%TritonX-100 室溫孵育30 min，5%BSA 封閉30 min。添加β-tubulinⅢ抗體4℃過夜。熒光二抗避光孵育1 h。DAPI 染色15 min，以DAPI 和的β-tubulinⅢ陽性細胞數占總細胞數的百分比作為神經元陽性率（陽性率＞95%為標準）。

1.3.3 細胞分組及處理 將海馬神經元分為3 組，分別為對照組、B[a]P 組（20 μmol/L B[a]P）、B[a]P+5-Azacd R 組（20 μmol/L B[a]P+10 μmol/L 5-Aza-cdR）。待細胞生長至第5 天，海馬神經元用5-Aza-cdR 處理24h，暴露于B[a]P 24 h。鏡下觀察細胞形態。

1.3.4 CCK8 檢測細胞活力 細胞分組干預，每組設置4個復孔。每孔加入10 μl CCK8 檢測液，37℃孵育2 h。酶標儀測定吸光度值。細胞活力（%）=[（實驗孔-空白孔）/（對照孔-空白孔）]×100%

1.3.5 免疫印跡法檢測DNMTs 蛋白表達 各組細胞加入80 μl 裂解液，收集蛋白裂解液，BCA 法測定蛋白濃度。電泳、電轉、封閉，孵育一抗DNMT1（1∶1 000）、DNMT3A（1∶4 000）、DNMT3B（1∶3 000）和β-actin（1∶10000）。4℃孵育過夜，加入二抗（1∶5000）室溫孵育2h。以目的蛋白與內參蛋白的條帶灰度值比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.3.6 定量反轉錄PCR 測定DNMTs 基因表達 Trizol提取細胞RNA，根據反轉錄試劑盒說明書合成cD-NA，-20℃保存，取少量cDNA 進行PCR 擴增，反應體系共20μl：MasterMix10 μl，cDNA 1 μl，正向引物0.6 μl，反向引物0.6μl，ddH2O7.8μl。實驗重復3 次，采用2-△△Ct法計算基因的相對表達量。

表1 DNMTs 引物序列

1.3.7 5-mC 免疫熒光法檢測總甲基化水平 多聚甲醛固定，山羊血清封閉。每孔加入50 μl 5-mC 抗體4℃過夜。加入熒光二抗，熒光顯微鏡下觀察。平均熒光強度=熒光強度總和/總面積。

1.3.8 細胞凋亡檢測 多聚甲醛固定20 min，滴加50 μl Hoechst33342 工作液，熒光顯微鏡下進行觀察。細胞凋亡率=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.4 統計學方法

采用SPSS 26.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料采用均數±標準差（）表示，組間比較釆用LSD-t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 海馬神經元的形態學觀察和鑒定結果

剛接種的海馬神經元呈圓形或多角形，透光性好，分布較均勻。1 d 后細胞突起生長快，數目增加。4～5 d后神經元突起增長，相互連接成神經纖維網狀結構，見圖1。神經元陽性率＞95%，見圖2。

圖1 海馬神經元形態

圖2 神經元鑒定結果

2.2 各組細胞形態和活力的變化

對照組神經元形態正常，結構完整。B[a]P 組可見細胞數量較少，突起皺縮，突起間連接斷裂；B[a]P+5-Aza-cdR 組可見少量萎縮細胞。與對照組比較，B[a]P組細胞活力降低（P＜0.05）。與B[a]P 組比較，細胞活力在B[a]P+5-Aza-cdR 組升高（P＜0.05）。見圖3。

圖3 海馬神經元形態和活力變化

2.3 各組細胞DNMTs 蛋白表達結果

與對照組比較，B[a]P 組DNMT3A、DNMT3B 蛋白的表達增高（P＜0.05），DNMT1 表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。與B[a]P 組比較，B[a]P+5-AzacdR 組DNMTs 的蛋白表達水平表達降低（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組細胞DNMTs 蛋白表達

2.4 各組細胞DNMTs 基因表達結果

與對照組比較，B[a]P 組DNMT1、DNMT3A 基因表達水平升高（P＜0.05）。DNMT3B 表達水平無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05）。與B[a]P 組比較，B[a]P+5-Aza-cdR 組DNMTs 基因表達水平降低（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組細胞DNMTs 基因表達

2.5 各組細胞總甲基化水平表達結果

與對照組比較，B[a]P 組的熒光信度變強，總甲基化水平升高（P＜0.05）。與B[a]P 組比較，B[a]P+5-Aza-cdR組總甲基化水平降低（P＜0.01）。見圖6。

圖6 各組細胞總甲基化水平表達結果

2.6 各組細胞凋亡結果

與對照組比較，B[a]P 組可以觀察到核濃染，核破碎現象，凋亡細胞增多，凋亡率升高（P＜0.05）。與B[a]P 組比較，B[a]P+5-Aza-cdR 組可以觀察到少量凋亡細胞，海馬神經元的凋亡率明顯降低（P＜0.01）。見圖7。

圖7 各組細胞凋亡結果

3 討論

B[a]P 神經毒性的作用機制主要有以下4 種：一是改變神經遞質及相關受體誘發神經毒性；二是干擾基因的表達誘發神經毒性；三是改變氧化應激而引起神經毒性[15-17]；四是從表觀遺傳學方面引起神經毒性[18]。研究表明，細胞內鋅缺乏可能會改變甲基化相關蛋白及基因的表達，并進一步誘導神經元損傷[19]。隨著B[a]P染毒劑量的增加，DNMTs 表達量顯著增加，提示DNMTs 在B[a]P 誘導的小鼠學習和記憶功能損害中起著重要作用[20]。5-Aza-cdR 對小鼠海馬PP1γ 的表達具有抑制作用，與小鼠學習記憶和突觸可塑性有關[21-22]。研究發現5-Aza-cdR 能抑制DNMTs 等基因的表達，從而影響細胞的生長和凋亡[23]，還可以顯著降低DNA甲基化水平，同時大鼠的學習能力也明顯提升[24]。5-Aza-cdR 可抑制DNA 甲基化而改善七氟醚誘導的記憶基因表達下降[25]。

本研究結果顯示，5-Aza-cdR 對B[a]P 誘導的海馬神經元毒性有保護作用。可能的機制是5-Aza-cdR可降低DNMTs 基因和蛋白的表達水平，降低細胞的總甲基化水平。在后續的實驗中，將進一步從表觀遺傳學方面深入探討5-Aza-cdR 對B[a]P 誘導海馬神經元毒性的作用，為B[a]P 神經毒性的防治提供了一定的作用靶點。