hsa_circ_0006988誘導膠質瘤細胞鐵死亡的機制研究

趙水強 孟大偉 陳國強 李亮亮 王志文 胡甜甜 牛建星

北京航空總醫(yī)院神經外科，北京 100012

膠質瘤屬于神經系統(tǒng)惡性腫瘤，手術切除、放療、化療等常見治療手段雖然能夠在一定程度上緩解膠質瘤進展，但治療后的多數患者生存時間低于5 年，尋找有效方法抑制膠質瘤具有重大研究價值[1-2]。鐵死亡是近些年來發(fā)現的細胞程序性死亡，氧化應激、Fe2+含量增多是其較為典型的特征，誘導腫瘤細胞鐵死亡也成為腫瘤治療中的研究熱點[3-4]。circRNA 是高度穩(wěn)定的非編碼RNA，其是由前體RNA 經過反向剪接而產生的，circRNA 在人體內的多種組織中表達，并且有多種生物學功能[5-6]。研究證明[7-8]，腫瘤的進展也受到circRNA 的表達調控，靶向改變circRNA 的表達可能是腫瘤治療的潛在途徑之一。既往文獻[5]顯示，hsa_circ_0006988（circ_0006988）促進非小細胞肺癌細胞增殖，誘導腫瘤生長。目前尚未發(fā)現circ_0006988在膠質瘤細胞鐵死亡中的作用研究。Nrf2/GPX4 信號可增加機體抗氧化能力，參與氧化應激、鐵死亡、腫瘤等生理、病理過程[9-11]。本實驗探討下調hsa_circ_0006988 作用于Nrf2/GPX4 信號誘導膠質瘤細胞鐵死亡的機制，為膠質瘤靶向基因治療提供參考思路，為研究膠質瘤分子發(fā)生機制提供數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

腦正常膠質細胞HEB（BNCC358606），購自上海撫生實業(yè)有限公司；膠質瘤細胞A172（貨號：CL0016），武漢普諾賽生命科技有限公司；膠質瘤細胞SHG44（貨號：CTCC-007-0459），購自湖南豐暉生物科技有限公司；膠質瘤細胞CHG-5（貨號：YS1481M），購自美 國ATCC；siRNA control、circ_0006988 siRNA、Nrf2 siRNA、陰性對照載體（pcDNA）、Nrf2 過表達載體（pcDNA-Nrf2），湖南普拉特澤生物科技有限公司提供；兔抗轉鐵蛋白受體（trasferrin-receptor，TFR）抗體（貨號：ab185550）、兔抗Ferritin 抗體（貨號：ab75973）、兔抗Nrf2 抗體（貨號：ab62352），兔抗轉鐵蛋白（Trans ferrin,TF）抗體（貨號：ab277635），Fe2+檢測試劑盒（貨號：ab83366）購自美國Abcam；兔抗GPX4 抗體（貨號：MABS1274）購自美國Sigma 公司；cDNA 第一鏈合成試劑盒（貨號：K1622）、ROS 測定試劑盒（貨號：E004-1-1），購自北京百奧萊博科技有限公司；MDA測定試劑盒（貨號：A003-3-1），購自北京中昊新生科技有限責任公司；熒光定量PCR 試劑盒SYBR Green qPCR Mix（貨號：MCE HY-K0501），購自天津邁基生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組 膠質瘤細胞CHG-5 培養(yǎng)參數設置為37℃，5%CO2，細胞培養(yǎng)在添加有10%胎牛血清的RPMI1640 細胞培養(yǎng)液中。膠質瘤細胞CHG-5 分為Control 組、si-NC 組、si-circ 組、si-Nrf2 組、si-circ+Vector 組、si-circ+Nrf2 組，Control 組為空白對照，si-NC組、si-circ 組、si-Nrf2 組細胞分別轉染siRNA Control組、circ_0006988 siRNA 組、Nrf2 siRNA 組，si-circ+Vector 組細胞共轉染circ_0006988 siRNA、陰性對照載體，si-circ+Nrf2 組細胞共轉染circ_0006988 siRNA、Nrf2 過表達載體。細胞轉染操作方法完全根據Lipofectamine 2000 說明書進行。

1.2.2 qRT-PCR 方法檢測circ_0006988 表達 收集腦正常膠質細胞HEB 和膠質瘤細胞A172、SHG44、CHG-5，或者收集按照“1.2.1”中方法分組（Control 組、si-NC 組、si-circ 組）處理24 h 后的細胞，經PBS 洗滌2 次后，用Trizol 試劑提取總RNA，cDNA第一鏈合成試劑盒反轉錄，熒光定量PCR 試劑盒SYBR Green qPCR Mix 進行熒光定量PCR。反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 個循環(huán)；設置GAPDH 作為參照，結果按照2-△△Ct法計算目的基因的表達變化。PCR 引物序列，circ_0006988 正向引物：5’-CTGCAACGTCACCTACAACG-3’，circ_0006988 反向引物：5’-CACCACCAG-CACAAAAATGA-3’；GAPDH 正向引物：5’-CTCCTCCACCTTTGACGCT-3’，GAPDH 反向引物：5’-GGGTCTCTCTC-TTCCTCTTGTG-3’。

1.2.3 比色法檢測Fe2+收集按照“1.2.1”中方法分組處理24 h 后的膠質瘤細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，收集細胞，添加4 倍體積的鐵檢測緩沖液，4℃，16 000 g 離心10 min，吸取上清備用。吸取50 μl 上清液添加到96 孔板，再補充50 μl 的Fe2+分析緩沖溶液，然后繼續(xù)添加5 μl 的分析緩沖液，放在25℃孵育30 min。把100 μl 的Fe2+探針加入測試孔或標準品孔內，在25℃孵育30 min。酶標儀測定593 nm 的OD值。然后根據標準曲線計算Fe2+含量。

1.2.4 Western blot 檢測Nrf2、GPX4、Ferritin、TF、TFR 蛋白表達 收集按照“1.2.1”中方法分組處理24 h 后的膠質瘤細胞，加入蛋白提取試劑，細胞刮刀收集細胞，4℃，12 000 g 離心10 min，吸取蛋白上清備用。配制10%的分離膠、5%的濃縮膠。蛋白樣品在添加到樣品孔之前，首先需要與5×Loading Buffer 混合煮沸5 min。每個孔內添加蛋白量為40 μg。80 V 電壓電泳20 min，100 V 電壓電泳1 h。PVDF 膜放在甲醇中活化，100 V 電壓轉膜2 h。PVDF 膜經過5%脫脂奶粉將非特異性的結合位點封閉以后，放在稀釋以后的一抗（Nrf2、TFR 按照1∶1 000 稀釋，GPX4、Ferritin、TF 抗體按照1∶800 稀釋）溶液中，4℃孵育12 h。PVDF膜放在稀釋后的抗溶液中，室溫結合2 h。ECL 顯色，顯影。Image J 分析條帶的灰度值，根據灰度值計算目的蛋白的表達差異，GAPDH 作為參照。

1.2.5 ROS、MDA 檢測 收集按照“1.2.1”中方法分組處理24 h 后的膠質瘤細胞，利用ROS 測定試劑盒（DCFH-DA 法）、MDA 測定試劑盒（硫代巴比妥酸法）檢測ROS、MDA 水平。ROS 結果以相對熒光強度表示。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計學軟件進行數據分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差（）表示，采用t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 circ_0006988 在膠質瘤細胞的表達

膠質瘤細胞A172、SHG44、CHG-5 中circ_0006988表達水平高于腦正常膠質細胞HEB（P＜0.05）；膠質瘤細胞A172、SHG44 中circ_0006988 表達水平低于膠質瘤細胞CHG-5（P＜0.05）。circ_0006988 在膠質瘤細胞中表達上調，選擇表達水平最高的膠質瘤細胞CHG-5 進行后續(xù)實驗。見表1。

表1 腦正常膠質細胞HEB 和膠質瘤細胞A172、SHG44、CHG-5 中circ_0006988 表達水平（，n=9）

表1 腦正常膠質細胞HEB 和膠質瘤細胞A172、SHG44、CHG-5 中circ_0006988 表達水平（，n=9）

注 與HEB 比較，aP＜0.05；與CHG-5 比較，bP＜0.05

2.2 下調circ_0006988 對膠質瘤細胞鐵死亡的作用

si-circ 組膠質瘤細胞中，Fe2+含量、ROS、MDA 含量高于Control 組、si-NC 組，Ferritin、TF、TFR 蛋白表達高于Control 組、si-NC 組（P＜0.05）。見圖1～2、表2。

圖1 Western blot 檢測circ_0006988 siRNA 轉染后膠質瘤細胞Ferritin、TF、TFR 蛋白表達差異

圖2 DCFH-DA 法檢測ROS 含量（200×）

表2 circ_0006988 siRNA 轉染后膠質瘤細胞中circ_0006988 表達水平和Ferritin、TF、TFR 蛋白表達及Fe2+、ROS、MDA 含量（，n=9）

表2 circ_0006988 siRNA 轉染后膠質瘤細胞中circ_0006988 表達水平和Ferritin、TF、TFR 蛋白表達及Fe2+、ROS、MDA 含量（，n=9）

注 與Control 組比較，aP＜0.05；與si-NC 組比較，bP＜0.05。ROS：活性氧；MDA：丙二酸

2.3 下調circ_0006988 抑制膠質瘤細胞中Nrf2/GPX4信號激活

si-circ 組膠質瘤細胞中Nrf2、GPX4 蛋白表達低于Control 組、si-NC 組（P＜0.05）。見圖3、表3。

圖3 Western blot 檢測circ_0006988 siRNA 轉染后膠質瘤細胞中Nrf2/GPX4 信號蛋白表達

表3 circ_0006988 siRNA 轉染后膠質瘤細胞中Nrf2、GPX4 蛋白表達水平（，n=9）

表3 circ_0006988 siRNA 轉染后膠質瘤細胞中Nrf2、GPX4 蛋白表達水平（，n=9）

注 與Control 組比較，aP＜0.05；與si-NC 組比較，bP＜0.05

2.4 激活Nrf2/GPX4 信號逆轉下調circ_0006988 對膠質瘤鐵死亡作用

si-circ 組膠質瘤細胞Nrf2、GPX4 蛋白表達低于si-NC 組，Fe2+含量，Ferritin、TF、TFR 蛋白表達，ROS、MDA 含量高于si-NC 組（P＜0.05）；si-circ+Nrf2 組膠質瘤細胞Nrf2、GPX4 蛋白表達高于si-circ+Vector組，Fe2+含量，Ferritin、TF、TFR 蛋白表達，ROS、MDA含量低于si-circ+Vector 組（P＜0.05）。見圖4～5、表4。

圖4 Western blot 檢測Nrf2 過表達載體、circ_0006988 siRNA共轉染后膠質瘤細胞中Nrf2、GPX4、TF、TFR、Ferritin 蛋白表達變化

表4 Nrf2 過表達載體、circ_0006988 siRNA 轉染后膠質瘤Nrf2、GPX4、Ferritin、TF、TFR 蛋白表達及Fe2+、ROS、MDA 含量（，n=9）

表4 Nrf2 過表達載體、circ_0006988 siRNA 轉染后膠質瘤Nrf2、GPX4、Ferritin、TF、TFR 蛋白表達及Fe2+、ROS、MDA 含量（，n=9）

注：與si-NC 組比較，aP＜0.05；與si-circ+Vector 組比較，bP＜0.05。ROS：活性氧；MDA：丙二醛

3 討論

研究circRNA 在膠質瘤中的作用，對于基因靶向治療膠質瘤具有重要意義[12-15]。文獻顯示[8]，circ_0006988在非小細胞肺癌中表達上調，并且circ_0006988 可促進腫瘤細胞增殖，circ_0006988 可能是腫瘤促進因子。本實驗顯示，膠質瘤細胞中circ_0006988 表達水平高于正常膠質細胞，并且下調circ_0006988 抑制膠質瘤細胞增殖，circ_0006988 可能具有促進膠質瘤進展的功能，這與之前的研究報道結果一致，均說明circ_0006988 可能發(fā)揮類似癌基因的作用。

鐵死亡表現為脂質過氧化物積累、氧化應激[10-11]。MDA、ROS 含量變化可間接反映氧化應激水平和鐵死亡變化[12-13]。Ferritin、TF、TFR 是與鐵死亡有關的蛋白調控因子，Ferritin、TF、TFR 在鐵死亡中過表達[14-15]。本實驗發(fā)現，下調circ_0006988 后的膠質瘤細胞中Fe2+含量增加，ROS、MDA 水平增加，Ferritin、TF、TFR 蛋白表達增多，提示下調circ_0006988 促進膠質瘤細胞鐵死亡，這可能是circ_0006988 調控膠質瘤進展的重要原因之一。Nrf2 是機體多種解毒酶的激活因子，在細胞受到損傷時，Nrf2 表達上調促進細胞增加抗氧化能力，減輕細胞損傷[16-17]。研究顯示[18-20]，Nrf2 能夠誘導GPX4 表達，而GPX4 也被認為是鐵死亡的核心，抑制GPX4 能夠加快細胞氧化應激和鐵死亡。本研究顯示，下調circ_0006988 降低了膠質瘤細胞中Nrf2、GPX4 表達水平，且抑制Nrf2/GPX4 信號降低膠質瘤細胞增殖能力，提高細胞中Fe2+、ROS、MDA 水平，促進Ferritin、TF、TFR 蛋白表達，并且下調circ_0006988 可能通過抑制Nrf2/GPX4 信號誘導膠質瘤細胞鐵死亡[21-25]。進一步用逆轉實驗驗證發(fā)現，激活Nrf2/GPX4 信號部分逆轉了下調circ_0006988 對膠質瘤細胞增殖、鐵死亡的作用，這提示下調circ_0006988 通過抑制Nrf2/GPX4 信號誘導膠質瘤細胞鐵死亡，抑制細胞增殖。

綜上，circ_0006988 在膠質瘤中可能發(fā)揮促進作用，靶向抑制circ_0006988 可能是膠質瘤治療的途徑之一，下調circ_0006988 可在體外誘導膠質瘤細胞鐵死亡，作用機制與抑制Nrf2/GPX4 信號有關，這為研究circ_0006988 在膠質瘤中的作用機制提供了參考，為膠質瘤的分子靶向治療提供了參考方向。

圖5 DCFH-DA 法檢測ROS 含量（200×）