六盤山野生大球蓋菇分離鑒定及生物學(xué)特性初探

李 穎 高有錢 林戎斌 賈寶光 王正安 賈 旭

（1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院固原分院 寧夏 固原 756000；2.固原市六盤山林業(yè)局 寧夏 固原 756000;3.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所 福建 福州 350013）

大球蓋菇（Stropharia rugosoannulata）又名皺環(huán)球蓋菇、 酒紅色球蓋菇、 裴氏球蓋菇， 屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、 傘菌綱（Agaricomycetes）、 傘菌目（Agaricaler）、 球蓋菇科（Strophariaceae）、 球蓋菇屬（Stropharia）[1]。 大球蓋菇作為栽培管理粗放的特色食用菌之一，其質(zhì)地鮮嫩，對(duì)人體有益的多糖類、蛋白質(zhì)、礦質(zhì)元素及維生素等物質(zhì)含量豐富，并具有抗腫瘤、抗氧化等功效，是一種集營養(yǎng)、療效于一體的食、藥兼用菌，具有廣闊的市場(chǎng)前景及商業(yè)生產(chǎn)潛力。 我國云南、吉林、西藏等地有野生大球蓋菇分布[2]，國內(nèi)專家學(xué)者也對(duì)其做了相關(guān)研究報(bào)道。 李碧瓊等[3]首次對(duì)莆田老鷹尖自然保護(hù)區(qū)的野生食用菌資源進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)了野生大球蓋菇。 顏淑婉和劉勝貴等[4-5]對(duì)其大球蓋菇生物學(xué)特性進(jìn)行了研究， 確定了適宜其生長發(fā)育的碳源、氮源、pH 及生長溫度。 馬令法等[6]的研究表明，大球蓋菇菌核生長、菌落形成和菌絲生長的最優(yōu)碳源是葡萄糖，最優(yōu)氮源是酵母膏。 薩仁圖雅等[2]的研究表明，不同品種的大球蓋菇菌絲生長對(duì)碳源和氮源的需求不同。 大球蓋菇屬草腐菌，其抗逆性強(qiáng)，生態(tài)習(xí)性范圍廣，野生大球蓋菇主要生長在闊葉林下的落葉層及針闊混交林中。 我國西北地區(qū)生態(tài)環(huán)境條件十分脆弱，生物種類相對(duì)稀少，大多數(shù)物種表現(xiàn)為抗旱、抗寒及耐鹽堿等生物學(xué)特性，研究六盤山的野生大球蓋菇資源， 對(duì)保護(hù)當(dāng)?shù)卮嗳醯纳鷳B(tài)系統(tǒng)和生物多樣性， 同時(shí)對(duì)發(fā)展當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)具有重要意義與科學(xué)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

六盤山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū) （35°15′~35°41′ N，106°09′～106°31′ E） 位于寧夏南部黃土高原西部，處于干旱向半濕潤過渡的地帶， 是黃土高原植被覆蓋良好、生物多樣性、徑流與森林資源最豐富的地區(qū)之一，素有黃土高原的“綠島”和“濕島”之稱，是我國西北地區(qū)重要的水源涵養(yǎng)基地和生態(tài)屏障， 橫貫陜甘寧3 個(gè)省份，總面積為6.78 萬hm2，是寧夏3 大次生林區(qū)之一，種質(zhì)資源豐富，素有“西北種質(zhì)資源基因庫”之稱，特有的地形地貌和氣候?yàn)橐吧秤镁姆毖芴峁┝说锰飒?dú)厚的環(huán)境條件。

1.2 供試材料

1.2.1 子實(shí)體 子實(shí)體2021 年9 月28 日采集于六盤山國家森林公園。

1.2.2 培養(yǎng)基 PDA 固體培養(yǎng)基： 馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L，自然pH。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、尿素2 g、磷酸二氫鉀1g、硫酸鎂0.5 g、瓊脂18 g、去離子水1 000 mL。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 組織分離及純化 采用組織分離法對(duì)樣本子實(shí)體進(jìn)行菌種分離。 首先用70%酒精棉擦洗菌蓋及菌柄部位進(jìn)行表面消毒，在酒精燈火焰附近，用手將子實(shí)體從菌柄基部向菌蓋處撕開， 用燃燒后的手術(shù)刀片將菌蓋與菌柄之間的菌肉切成小方塊， 然后用滅過菌的鑷子夾取一小塊菌肉組織， 放入事先準(zhǔn)備好的裝有無菌培養(yǎng)基的PDA 平板培養(yǎng)基中， 置于25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)， 標(biāo)記為Q1。 菌絲直徑達(dá)到2 cm 后，進(jìn)行純化培養(yǎng)。1.3.2 菌種鑒定 采用真菌基因組提取試劑盒 （天根） 分別對(duì)大球蓋菇的子實(shí)體和分離培養(yǎng)得到的菌絲體進(jìn)行基因組DNA 提取。 采用通用引物ITS1 和ITS4 （TS1：5-TCCGTAGGT-GAACCTGCGG-3；ITS4：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）用于rDNA ITS 區(qū)段的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為50 uL，其中包含35.5 uL去離子水、5 uL10×PCR buffer、4 uL dNTPs（2.5 mmol/L）、ITSl 和ITS4 引物各2 uL、0.5 μL Tag DNA 酶（5 U/uL）、1 uL 模板DNA（濃度20～50 mg/L）。 PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù) 變 性5 min；94℃變 性30 s，55℃退 火30 s，72℃延伸40 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃反應(yīng)7 min。 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后4℃保存。1.3.3 生物學(xué)特性分析 采用微生物平板培養(yǎng)法，通過測(cè)定不同碳源、 氮源及無機(jī)鹽培養(yǎng)基上菌絲長勢(shì)、生長指數(shù)、菌落直徑、菌落形成時(shí)間、菌落長勢(shì)、菌絲生長速度等指標(biāo)來研究不同培養(yǎng)基配方對(duì)球蓋菇屬菌絲生長的影響， 并采用十字交叉劃線法標(biāo)記1 次菌落直徑，持續(xù)標(biāo)記3 次，記錄菌絲日均長速和菌絲長度。 每個(gè)配方5 個(gè)重復(fù)，注意記錄霉變情況，對(duì)霉變的平板要及時(shí)處理。

（1）碳源試驗(yàn)。以基礎(chǔ)培養(yǎng)基中葡萄糖20 g 的含碳量為標(biāo)準(zhǔn)，分別以相同含碳量的蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、 甘露醇、 乳糖代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，并以不添加任何碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作對(duì)照，研究不同碳源物質(zhì)對(duì)供試菌菌絲生長的影響。

（2）氮源試驗(yàn)。 以基礎(chǔ)培養(yǎng)基中尿素2 g 的含氮量為標(biāo)準(zhǔn)，分別以相等含氮量的硝酸鉀、蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、尿素、酵母粉代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的尿素，并以不添加任何氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作對(duì)照，研究不同氮源物質(zhì)對(duì)供試菌菌絲生長的影響。

（3）無機(jī)鹽試驗(yàn)。 分別用硫酸鐵、硫酸鈣、硫酸鋅、硫酸銅和硫酸錳代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的硫酸鎂，并以不加硫酸鎂的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作對(duì)照， 其中常量元素添加量為0.5 g/L，微量元素添加量為0.06 g/L，研究不同無機(jī)鹽物質(zhì)對(duì)供試菌菌絲生長的影響。

1.4 項(xiàng)目測(cè)定

測(cè)定不同培養(yǎng)基上球蓋菇的菌落直徑， 并對(duì)菌落長勢(shì)進(jìn)行評(píng)分，研究不同碳源、氮源和無機(jī)鹽對(duì)球蓋菇菌絲生長的影響。 觀察、記錄每個(gè)菌株的菌落直徑、顏色、長勢(shì)、疏密度、平均生長速率等情況。

具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：菌絲長勢(shì)濃密、均勻，5 分；菌絲長勢(shì)較濃密、較均勻，4 分；菌絲長勢(shì)較稀疏、較均勻，3 分；菌絲長勢(shì)較稀疏、不均勻，2 分；菌絲長勢(shì)稀疏、不均勻，1 分。

菌落直徑（mm）：用直尺任意測(cè)量3 次，取平均值。

菌絲生長指數(shù)=菌絲長勢(shì)評(píng)分×菌絲生長速率；菌絲日均長速（mm/d）=[（菌落直徑-6）/2]/培養(yǎng)天數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel、SPSS 17.0 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離培養(yǎng)

在秋季， 寧夏六盤山國家森林公園發(fā)現(xiàn)獲得野生大球蓋菇子實(shí)體，其單生或群生于枯枝落葉層中，菌蓋直徑5.5～8.0 cm，扁半球形至扁平，濕時(shí)稍黏，蓋緣光滑或覆叢毛狀鱗片，附著較多的菌幕殘片，深葡萄酒褐色。 菌褶直生，膜質(zhì)，淺灰色至紫褐色；褶緣鋸齒狀，白色。 菌柄長6～12 cm，直徑0.9～2.0 cm，圓柱形至基部近球根狀，白色至奶油色菌環(huán)厚。 野生大球蓋菇子實(shí)體經(jīng)組織分離后獲得純種菌絲Q1， 對(duì)大球蓋菇菌落的平板培養(yǎng)進(jìn)行觀察， 可以看出菌絲生長濃密， 顏色為潔白色， 菌落絨毛狀， 圓形， 平坦，有放射狀紋。 對(duì)大球蓋菇菌株的菌絲進(jìn)行顯微觀察， 發(fā)現(xiàn)菌絲細(xì)胞含有雙核， 且具有明顯的鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)。 從菌絲生長速率來看，大球蓋菇Q1 菌絲生長速率為2.68 mm/d（圖1）。

圖1 野生大球蓋菇子實(shí)體及菌落Q1 的平板培養(yǎng)

2.2 菌種鑒定

測(cè)序結(jié)果登錄GenBank 核酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast 比對(duì)， 與登錄號(hào)MH860190.1 （Stropharia rugosoannulata）的菌種覆蓋度最高達(dá)100%，相似性達(dá)99.85%。 下載相似高的ITS 序列，用Clustal W 進(jìn)行序列比對(duì)，基于分離株Q1 以及來自GenBank 的最相似球蓋菇屬15 個(gè)種的ITS 序列，用MEGA2.0 軟件采用ML 法構(gòu)建系統(tǒng)樹（采用默認(rèn)值，圖2）。 從系統(tǒng)發(fā)育樹可看出，菌種Q1 與球蓋菇屬中的大球蓋菇聚為一支，結(jié)合形態(tài)特征，鑒定分離菌種為大球蓋菇。

圖2 基于ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 菌絲生物學(xué)特性

2.3.1 不同碳源對(duì)大球蓋菇菌絲生長發(fā)育的影響6 種碳源均可以被大球蓋菇菌絲所利用（表1），說明大球蓋菇Q1 對(duì)碳源利用譜較廣。 其中以葡萄糖和蔗糖作為碳源時(shí)大球蓋菇菌絲長勢(shì)最強(qiáng)， 菌絲健壯而濃密，與其他碳源相比差異顯著。 其按照菌絲生長速率順序?yàn)槠咸烟?蔗糖＞可溶性淀粉＞麥芽糖=乳糖=甘露醇＞無碳源。 結(jié)合菌絲長勢(shì)與密度發(fā)現(xiàn)，大球蓋菇菌絲生長的最適碳源為葡萄糖和蔗糖。

表1 不同碳源對(duì)大球蓋菇菌絲生長及生長勢(shì)的影響

2.3.2 不同氮源對(duì)大球蓋菇菌絲生長發(fā)育的影響由表2 可知， 結(jié)合大球蓋菇菌絲生長勢(shì)和生長速率分析， 菌絲在酵母浸粉為氮源的培養(yǎng)基上生長快而健壯，菌絲濃密，與其他氮源培養(yǎng)基上的菌絲生長指數(shù)差異顯著； 菌絲在硫酸銨和硝酸鉀為氮源的培養(yǎng)基上菌絲生長速率較快， 在硫酸銨培養(yǎng)基上生長快而較健壯，菌絲較濃密，但是菌絲在硝酸鉀培養(yǎng)基上長勢(shì)差，菌絲稀疏，故不宜選用硝酸鉀。 試驗(yàn)表明，大球蓋菇菌絲生長的最適氮源為酵母浸粉。

表2 不同氮源對(duì)大球蓋菇菌絲生長及生長勢(shì)的影響

2.3.3 不同無機(jī)鹽對(duì)大球蓋菇菌絲生長發(fā)育的影響不同無機(jī)鹽對(duì)大球蓋菇菌絲生長具有一定的影響，在添加硫酸鐵的培養(yǎng)基上，菌絲生長速率最快，但菌絲長勢(shì)一般。 在不添加無機(jī)鹽的培養(yǎng)基上，與其他培養(yǎng)基的菌絲生長指數(shù)相比差異顯著，菌絲長勢(shì)較強(qiáng)，密度較濃密，試驗(yàn)表明，大球蓋菇菌絲生長過程中可不添加無機(jī)鹽（表3）。

表3 不同無機(jī)鹽對(duì)大球蓋菇菌絲生長及生長勢(shì)的影響

3 討論與結(jié)論

六盤山野生大球蓋菇發(fā)生季節(jié)在秋季， 單生或群生于草地或枯枝落葉層， 采用組織分離法對(duì)野生大球蓋菇子實(shí)體進(jìn)行分離，成功分離、純化得到野生大球蓋菇菌種Q1。 通過ITS 序列分析法對(duì)供試子實(shí)體與菌絲體進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序、對(duì)比，驗(yàn)證子實(shí)體為大球蓋菇子實(shí)體的分離物，分離獲得的菌絲體Q1 為大球蓋菇菌種。

大球蓋菇菌絲體生長最適碳源為葡萄糖和蔗糖，最適氮源為酵母浸粉，這一結(jié)果與顏淑婉等[7]的試驗(yàn)中大球蓋菇菌種St0128 菌絲生長適宜條件一致。 無機(jī)鹽試驗(yàn)結(jié)果表明， 硫酸鐵促進(jìn)大球蓋菇Q1菌絲體生長，而硫酸鈣抑制菌絲體生長，結(jié)合菌絲體生長長勢(shì)得出， 大球蓋菇菌絲體生長最適的為不添加無機(jī)鹽處理，該結(jié)果與閆培生等[8]、馬令法等[6]的研究結(jié)果不同。