常規粳稻浙粳78 優質雙抗的分子特征分析

陳佑源 蔣寧飛 尚子帥 巫明明 葉 靖 葉勝海

（1.浙江勿忘農種業股份有限公司 浙江 杭州 311215；2.建德市農業技術推廣中心 浙江 建德 311600；3.浙江省農業科學院作物與核技術利用研究所 浙江 杭州 310021）

21 世紀以來，浙江省水稻播種面積呈下降趨勢，2001 年全省稻谷種植面積134 萬hm2，2021 年約為63 萬hm2，僅為前者的47%。 盡管如此，水稻依舊是浙江省第一大糧食作物，年均產量498.78 萬t，占糧食總產的83.13%[1]。然而，浙江地處亞熱帶中部，屬季風性濕潤氣候， 氣溫適中， 光照充足， 雨量豐沛，不僅是適宜水稻種植的重要地區， 同時也是水稻病蟲害如稻瘟病、 白葉枯病的高發區。 因此， 稻瘟病和白葉枯病已成為該地限制水稻產量和品質的兩大重要病害。 其中， 稻瘟病分布遍及世界各稻區， 流行年份稻谷一般減產10%~20%， 嚴重時減產40%~50%，局部田塊甚至顆粒無收， 每年損失的稻谷足以養活6 000 萬人口。 目前我國稻瘟病的平均發生強度、 年發生面積及稻谷損失分別為25.21%、380 萬~600 萬hm2及15 億~30 億kg[2-4]。 盡管浙江省稻瘟病平均發生強度全國最低，僅為4.46%，但近年來浙江部分地區存在大范圍發生趨勢[5-6]。 而白葉枯病則主要流行于我國華東、華南和華中稻區，一般造成稻谷產量損失10%~30%，嚴重時達50%，甚至絕收。 在20 世紀80～90 年代，該病在浙江省發生較重，而后總體趨勢為輕發，但2015 年后又趨于加重，甚至在浙東南部分區域連片暴發， 嚴重影響糧食生產安全及農藥減量增效工作成效[7-9]。 因此，面對“老問題新暴發”的水稻白葉枯病，2021 年浙江省將其列入首批二類農作物病蟲害名錄，同時自2022 年開始，在水稻區試審定標準中將白葉枯病抗性與稻瘟病抗性列為同等重要位置，同時實施“一票否決”制。

在水稻生產上，為了防治上述病害，一般通過噴施農藥或種植抗性水稻品種來控制， 但農藥防治既污染環境也危害人類身體健康。 目前農業供給側結構性改革正推動我國農業向綠色化轉型發展[10]。培育并推廣應用多抗水稻品種及品種合理布局， 減少農作物化學農藥用量，是實現農業綠色生態生產，保障農業生產安全、 農產品質量安全和生態環境安全的科學有效途徑。 為了適應新時代的生產要求，浙江省自2022 年開始實行水稻新品種審定標準，如多個優異性狀累計標準， 即在優質與抗性等方面優異性狀越多，則對產量要求相對放寬。 本研究基于稻米食味關鍵基因、 稻瘟病和白葉枯病抗性基因功能型或緊密連鎖分子標記，對單季常規粳稻浙粳78 的優質雙抗基因進行分子分析， 以期為該品種的推廣應用及進一步遺傳改良奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水稻品種浙粳78 （浙江勿忘農種業股份有限公司）種子發芽后，用Yoshida 營養液于組織培養室恒溫培養至3 葉1 心， 而后剪取完全展開葉用于基因組DNA 提取。

1.2 稻米品質、稻瘟病及白葉枯病抗性評價

評價數據均來源于國家水稻數據中心（http://www. ricedata.cn/variety/index.htm）。 稻瘟病及白葉枯病的相關數據均為2 年平均值。

1.3 基因組DNA 提取與抗性基因分子檢測

取0.1 g 水稻葉片， 用水稻基因組DNA 提取試劑盒（易思得生物科技有限公司）提取基因組DNA。

常規PCR 反應總體系20 μL，內含1× BlueStarTMPCR Master Mix（北京擎科生物科技有限公司）、上下游引物各1.5 μmol/L 及基因組DNA 50 ng。 PCR 反應程序： 95℃預變性5 min；94℃變性30 s，退火時間30 s，72℃延伸30~60 s，共35 個循環；72℃再次延伸5 min，最后保持在16℃。 PCR 產物采用2.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，用紫外凝膠成像儀拍照。 而需要測序或用CAPS/dCAPS 標記驗證的部分基因，PCR 反應總體系50 μL， 內含1× Phanta Max 緩沖液、dNTP 0.2 mmol/L、Phanta Max 高保真DNA 聚合酶 （南京諾唯贊生物科技股份有限公司）、 上下游引物各1.5 μmol/L 及基因組DNA 50 ng。 PCR 反應 程序：98℃預變性3 min；98℃變性10 s，退火時間15 s，72℃延伸30~60 s，共35 個循環；72℃再次延伸5 min，最后保持在16℃。 PCR 產物經2.5%瓊脂糖凝膠電泳后切膠純化DNA 片段，而后送北京擎科生物科技有限公司測序。 酶切反應體系：總體積30 μL，內含3 μL PCR 產物、1 μL 限制性內切酶及1× 反應緩沖液。 所有基因分析的相關引物序列見表1。

表1 抗病基因的分子標記和基因克隆的引物

2 結果與分析

2.1 稻米食味品質相關基因的分子特征

除Wx 基因外，Tian 等[11]和謝米雪等[12]根據關鍵核苷酸多態性均將水稻淀粉合成途徑中的其他重要基因分成2 種單倍型， 其中SBE3 基因的3’UTR 第63 個堿基的變異將導致SpeI 限制性內切位點的改變，缺失的為Ⅰ型，反之則為Ⅱ型；AGPiso 基因的終止密碼子下游第532 個堿基G 的變異導致EcoRI 限制性內切位點的改變，缺失的為Ⅰ型，反之則為Ⅱ型；AGPlar 基因的起始密碼子上游第1 633 個堿基存在C/T 的變異，含C 的為Ⅰ型，含T 的為Ⅱ型；ISA 基因的起始密碼子上游第1 499 個堿基存在C/G 的變異，含C 的為Ⅰ型，含G 的為Ⅱ型；SSII-3 基因的起始密碼子后的第4 329 個及第4 330 個堿基存在GC/TT的變異，含TT 的為Ⅰ型，含GC 的為Ⅱ型；SSI 基因的起始密碼子后的第3 216 個堿基存在A/T 的變異，含T 的為Ⅰ型，含A 的為Ⅱ型；SSIV-2 基因的起始密碼子后的第437 個堿基存在InDel 差異，擴增片段大小為210 bp 的為Ⅰ型，而片段大小為198 bp 的為Ⅱ型。 同時研究發現， 含有Ⅱ型SSI 和AGPlar 及Ⅰ型SSII-3 的稻米直鏈淀粉含量相對更低； 含Ⅰ型AGPiso、SBE3 和ISA 基因的稻米糊化溫度相對更低；含有Ⅱ型SBE3、ISA 和SSIV-2 及Ⅰ型SSII-3 的稻米堿消值相對更低。分析浙粳78 中的上述基因特性，結果發現SSII-3和SBE3 為I 型， 其他5 個基因為Ⅱ型（圖1）。

圖1 浙粳78 中與稻米食味及蒸煮品質相關基因的分子分型

2.2 稻瘟病抗性基因的鑒定

浙江省單季粳稻2 年區試結果顯示，浙粳78 的苗葉瘟均值及其最高級均值、穗瘟發病率均值及其最高級均值、穗瘟損失率均值及其最高級均值、稻瘟病綜合指數均值分別為1.5 級和3.0 級、5.5 級和7.0 級、1.5 級和2.0 級、2.9， 最終該品種的稻瘟病抗性定為中抗。 為了明確該品種中是否攜帶白葉枯病抗性基因， 利用已克隆抗性基因的功能型或緊密連鎖分子標記進行鑒定， 結果表明， 該品種中含有抗病基因Pish、Pib、Pi36、Pi-co39、Pita、Pikm2、Pik（圖2）。

圖2 稻瘟病抗性基因的PCR 鑒定

2.3 白葉枯病抗性基因的鑒定

2018 年和2019 年浙江省單季常規粳稻區試結果顯示，浙粳78 的白葉枯病均值及其最高級均值分別為2.0 級和3.0 級，該品種白葉枯病抗性綜合評定為中抗。 為了明確該品種中是否攜帶白葉枯病抗性基因， 利用已克隆抗性基因的功能型或緊密連鎖分子標記進行鑒定，結果表明，該品種中含有抗病基因Xa21（圖3）。 同時進一步對Xa25/xa25 基因測序并與已知抗性基因序列[13]比對分析，證實浙粳78 中含有抗病基因xa25（圖3、圖4）。

圖3 白葉枯病抗性基因的PCR 鑒定

圖4 xa25 基因的測序分析

3 討論與結論

優質稻米，不僅需要漂亮的外觀品質，更在于優異的內在蒸煮食味品質。 而后者是由糊化溫度、直鏈淀粉含量、膠稠度等理化指標間接決定，一般來說，優質稻米具有較低直鏈淀粉含量、 較高膠稠度和較低糊化溫度等優點。 研究顯示，含有Ⅰ型SSⅡ-3，Ⅱ型AGPlar 和SSⅠ稻米種質的直鏈淀粉含量相對更低； 含有Ⅱ型AGPsio、SBE3 和ISA 的膠稠度相對較高；而糊化溫度與堿消值反相關，含有Ⅱ型ISA 稻米種質的堿消值相對更低[11,14-15]。本研究結果顯示，浙粳78 中含有Ⅰ型SSⅡ-3 和SBE3， Ⅱ型ISA、AGPsio、SSIV-2、AGPlar 和SSⅠ。 因此，從直鏈淀粉及膠稠度的角度來看，該品種攜帶的基因均為優良基因，而從堿消值的角度來看，ISA 則不是優良基因。

要實現水稻生產的綠色生態發展， 培育多抗水稻新品種是最重要且經濟有效的途徑。 根據寄主與病原物互作的性質， 可以把植物抗病性區分為垂直抗病性（vertical resistance）和水平抗病性（horizontal resistance）兩類[16-17]。 其中前者是通過植物病害抗性基因識別和它對應的病原物Avr 基因， 并產生高效專化性抗性免疫反應，其抗性程度高、有效性強被廣泛用于現代抗病育種和生產上[18]。本研究利用多種病害抗性基因的功能型或緊密連鎖分子標記， 并結合部分基因的PCR 克隆及測序分析，結果證實浙粳78攜帶有Pish、Pib、Pi36、Pi-co39、Pita 和Pikm2 等稻瘟病抗性基因， 以及白葉枯病抗性基因xa25 和Xa21，從而賦予該品種稻瘟病及白葉枯病雙中抗抗性。