膽鹽誘導急性胰腺炎大鼠模型中TNF-α、IL-6、相關AMS 水平變化的研究

劉亞男，王哲，常鴻杰，胡立華

黑龍江省醫院香坊消化內二科，黑龍江哈爾濱 150036

急性重癥胰腺炎是伴有全身及局部并發癥的機械胰腺炎，屬于急性胰腺炎的特殊類型，是一種病情險惡、并發癥多、病死率較高的急腹癥，占整個急性胰腺炎的10%～20%[1]。隨著近年來對重癥急性胰腺炎的病理機制認知的逐漸加深，研究指出，重癥急性胰腺炎患者機體內出現炎性因子風暴，其胰腺外組織器官和胰腺細胞內的活動與免疫功能密切相關，炎性因子指標變化可引發重癥急性胰腺炎炎性介質變化、胰腺微循環改變，進而促使病情加重，其主要的炎性介質損傷因子包括腫瘤壞死因子-α、白介素6[2]。本研究納入黑龍江省醫院實驗中心2021 年1 月—2022 年7 月的成年大鼠（Wistar）50 只，分析膽鹽誘導急性胰腺炎大鼠模型中相關AMS、IL-6、TNF-α 指標變化，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入本實驗中心成年大鼠（Wistar）50 只，其中雌性24 只，雄性26 只；體質量239～280 g，平均（265.7±6.2）g，根據隨機雙盲法分組，分為膽鹽誘導急性胰腺炎組（n=26）、假手術組（n=24）。膽鹽誘導急性胰腺炎組雌性12 只，雄性14 只；體質量239～280 g，平均（264.3±6.0）g。假手術組雌性12 只，雄性12 只；體質量239～280 g，平均（265.6±6.3）g。本研究經本院醫學倫理委員會審批通過（倫理審批號：S2022-066-02）。

1.2 材料

美國Sigma 公司生產的牛黃膽酸鈉，美國Genzyine 公司生產的抗人單克隆抗體，TNF-α、IL-6 試劑盒，檢測TNF-α、IL-6最小值分別為40、12 ng/L；上海滬東儀器廠生產的微量輸液泵，天津南開大學電子儀器廠生產的LDF-III型激光多普勒血流計。

1.3 方法

全部研究對象操作前12 h 禁食，飲水自由，予以6 mg/kg 20%烏拉坦肌肉注射麻醉，后予以頸靜脈插管，另一側連接上海滬東儀器廠生產的微量輸液泵，膽鹽誘導急性胰腺炎組將5%牛黃膽酸鈉注射至胰管內，用藥劑量為0.1 g/100 g 計算，用藥速度為0.2 mL/min，假手術組予以開腹，予以十二指腸、胰腺輕揉，兩組均監測12 h。予以LDF-Ⅲ型激光多普勒血流儀在大鼠的體尾交界、胰頭處選擇相對固定、辨別度較高的部位，組織輕觸探頭即可，分析兩組實驗動物在開始0.5、1、1.5 、2、2.5、3 h 的胰腺血流量，基數為初始數據，計算各檢測值的百分數；在操作前、操作后2、4、6、12 h 經頸靜脈采集1 mL 血液，10 min 離心，速度為4 000 r/min，分離血清，置于-72°C 保存，予以雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗檢測血清中TNF-α、IL-6 指標變化；在操作前、操作后12 h 采集血清，監測其脂肪酶、淀粉酶含量；操作后12 h 將大鼠處死，10%福爾馬林固定胰腺組織，包埋石蠟，蘇木染色，光鏡監測下予以病理檢查，由病理科醫師評估其病理變化。

1.4 評定標準

胰腺病理學檢查評分：中性粒細胞浸潤（4 分）、壞死（3 分）、出血（2 分）、水腫（1 分）、正常（0 分）[3]。

1.5 觀察指標

觀察兩組實驗開始0.5、1、1.5、2、2.5、3 h 的胰頭部微循環血流量、胰體尾部微循環血量、腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、血清淀粉酶、血清脂肪酶、胰腺病理學檢查評分。

1.6 統計方法

應用SPSS 21.0 統計學軟件分析數據，計量資料用（±s）表示，組間差異比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠胰頭部微循環血流量比較

膽鹽誘導急性胰腺炎組實驗動物在開始0.5、1、1.5、2、2.5、3 h 的胰頭部微循環血流量低于假手術組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組大鼠胰頭部微循環血流量比較[(±s)，mL]

表1 兩組大鼠胰頭部微循環血流量比較[(±s)，mL]

組別膽鹽誘導急性胰腺組（n=26）假手術組（n=24）t 值P 值0.5 h 86.3±3.5 106.4±7.5 12.299＜0.001 1 h 81.3±3.4 109.7±5.6 21.869＜0.001 1.5 h 76.4±2.8 116.2±5.2 34.061＜0.001 2 h 61.3±2.4 109.7±4.6 47.170＜0.001 2.5 h 56.4±2.1 106.2±3.2 65.549＜0.001 3 h 39.3±1.7 100.7±2.6 99.583＜0.001

2.2 兩組大鼠胰體尾部微循環血流量比較

膽鹽誘導急性胰腺炎組實驗動物在開始0.5、1、1.5、2、2.5、3 h 的胰體尾部微循環血流量低于假手術組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組大鼠胰體尾部微循環血流量比較[(±s)，mL]

表2 兩組大鼠胰體尾部微循環血流量比較[(±s)，mL]

組別膽鹽誘導急性胰腺組（n=26）假手術組（n=24）t 值P 值0.5 h 66.3±3.6 106.3±7.3 24.870＜0.001 1 h 62.3±3.3 102.7±5.6 31.370＜0.001 1.5 h 59.4±2.7 100.2±5.1 35.744＜0.001 2 h 53.3±2.2 102.7±4.5 49.915＜0.001 2.5 h 50.4±2.0 106.2±3.1 76.224＜0.001 3 h 30.3±1.8 97.7±2.5 110.037＜0.001

2.3 兩組大鼠實驗前后的腫瘤壞死因子-α 指標比較

膽鹽誘導急性胰腺炎組大鼠在術后2、4、6、12 h腫瘤壞死因子-α 指標高于假手術組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組大鼠實驗前后的腫瘤壞死因子-α 指標比較[(±s)，pg/mL]

表3 兩組大鼠實驗前后的腫瘤壞死因子-α 指標比較[(±s)，pg/mL]

組別膽鹽誘導急性胰腺組（n=26）假手術組（n=24）t 值P 值術前60.3±7.6 59.2±7.3 0.521 0.605術后2 h 209.3±20.3 114.7±15.6 18.362＜0.001術后4 h 278.4±19.7 116.2±15.1 32.472＜0.001術后6 h 306.3±18.2 122.7±15.5 38.243＜0.001術后12 h 281.5±17.4 116.4±12.6 38.148＜0.001

2.4 兩組大鼠實驗前后的白介素-6 指標比較

膽鹽誘導急性胰腺炎組大鼠在術后2、4、6、12 h的白介素-6 指標高于假手術組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 兩組大鼠實驗前后的白介素-6 指標比較[(±s)，pg/mL]

表4 兩組大鼠實驗前后的白介素-6 指標比較[(±s)，pg/mL]

組別膽鹽誘導急性胰腺組（n=26）假手術組（n=24）t 值P 值術前96.3±7.6 96.2±7.3 0.047 0.962術后2 h 273.3±60.3 104.7±32.6 12.150＜0.001術后4 h 459.4±89.7 116.2±35.1 17.535＜0.001術后6 h 403.3±70.2 162.7±45.5 14.248＜0.001術后12 h 361.5±30.4 98.4±22.6 34.494＜0.001

2.5 兩組大鼠實驗前后的血清脂肪酶、血清淀粉酶指標比較

與實驗前相比，實驗后兩組的脂肪酶、血清淀粉酶均增高，且膽鹽誘導急性胰腺炎組高于假手術組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表5。

表5 兩組大鼠實驗前后的血清脂肪酶、血清淀粉酶指標比較[(±s)，U/L]

表5 兩組大鼠實驗前后的血清脂肪酶、血清淀粉酶指標比較[(±s)，U/L]

組別膽鹽誘導急性胰腺組（n=26）假手術組（n=24）t 值P 值血清脂肪酶實驗前30.7±2.4 29.8±2.1 1.406 0.166實驗后12 h 3 023.2±780.2 86.6±27.2 18.414＜0.001血清淀粉酶實驗前82.7±8.6 83.7±8.7 0.408 0.685實驗后12 h 1 740.7±55.6 148.7±37.1 118.052＜0.001

2.6 兩組大鼠胰腺病理組織學評分比較

膽鹽誘導急性胰腺炎組胰腺病理學中性粒細胞浸潤、壞死、出血、水腫評分高于假手術組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表6。

表6 兩組大鼠胰腺病理組織學評分比較[(±s)，分]

表6 兩組大鼠胰腺病理組織學評分比較[(±s)，分]

組別膽鹽誘導急性胰腺組（n=26）假手術組（n=24）t 值P 值中性粒細胞浸潤3.2±0.7 1.6±0.3 8.289＜0.001壞死2.7±0.2 1.3±0.7 5.690＜0.001出血1.2±0.3 0.9±0.2 4.124＜0.001水腫0.7±0.3 0.3±0.1 6.217＜0.001

假手術組胰腺病理示：腺泡、間質水腫，炎性細胞浸潤，少量散在出血壞死灶，見圖1；膽鹽誘導急性胰腺炎胰腺病理示：鏡下可見胰腺組織高度充血水腫，呈紫黑色、深紅色，胰腺組織結構被破壞，出現大量炎性細胞浸潤，大片出血壞死灶，見圖2。

圖2 膽鹽誘導急性胰腺炎胰腺病理

3 討論

近年隨著大量深入研究，人們對重癥急性胰腺炎的病理機制有了更全面、更深入的了解。重癥急性胰腺炎發病的中心環節包括激活異位胰蛋白酶原、WBC 依賴性炎性因子反應變化、胰腺的微循環受限[4-6]。目前，有研究指出，重癥急性胰腺炎除了具有以上局部病變外，屬于一種侵襲胰腺遠隔系統、臟腑組織、鄰近組織的全身性、急性、系統性炎性反應病變[7-8]。重癥急性胰腺炎其臨床特征為腎功能、呼吸功能不同程度的高動力循環，引發各臟腑組織器官功能衰竭。重癥急性胰腺炎的最初的受損反應為細胞分子網的炎性病變，機體啟動了各種炎性介質及細胞因子，進而引發炎性因子級聯反應、全身性病變，引發炎性因子反應風暴，導致病情迅速進展。而在重癥急性胰腺炎的病程中，腫瘤壞死因子-α、白介素-6 可在生物學效應、調節受體、誘生等不同層面相互影響，在發揮作用時與其他炎性介質形成級聯反應，屬于立體的復雜結構[9-10]。

白介素-6 屬于急性反應期的關鍵性炎性介質，屬于巨噬/單核細胞，可在腫瘤壞死因子-α、白介素1、內毒素等各種細胞作用下生成。對重癥急性胰腺炎的病情進展評估敏感指標之一為白介素-6；白介素-6 可在各種靶細胞內發揮作用，通過對炎性成熟細胞成分肝功能予以調節，進而促使炎性因子進展，促使炎性因子在炎性細胞的激化效應下引發多臟衰[10-11]。白介素-6 的具體病理機制包括：①和腫瘤壞死因子-α 發揮協同效應，可在微血管系統廣泛存在，促使血管內皮細胞的表型誘導為炎癥型，促使外源性凝血系統被激活，促進組織因子的急驟增高表達，過度激化血管內皮細胞，引發組織受損、形成微循環血栓[12-13]；②促使中性粒細胞凋亡周期延長，確保中性粒細胞生成氧自由基；③生成抗體、促進分化B 細胞、對白介素1 產生協同作用，對肝細胞的毒性、炎性因子反應發達，促進催化急性反應肝細胞合成蛋白，引發細胞組織受損[14-15]。重癥急性胰腺炎的TNF-α 的作用機制為：①在重癥急性胰腺炎早期最早增高的炎性介質為TNF-α，是導致白介素相關因子、自身表達基因，造成級聯反應的始發因子，可導致炎性介質釋放具有失控性；②可促使膜磷脂酶A1 激活，導致代謝花生四烯酸失衡，出現血小板活化因子，促使微循環障礙嚴重受限；對血管內皮細胞進行刺激，生成氧自由基、一氧化氮等介質[16-17]；③對炎性因子細胞激活，促使粘附分子增高，在血管內皮中粘附白細胞，促使血管的通透性增高；對組織纖溶酶原激活物進行滅活，進而對纖溶反應進行抑制，促使組織因子表達急驟增高，血栓調理素降低表達，對凝血系統激活，形成毛細血管微血栓。

本研究觀察膽鹽誘導急性胰腺炎大鼠模型中相關淀粉酶中白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α 指標變化，結果顯示：膽鹽誘導急性胰腺炎組實驗動物在開始0.5、1、1.5、2、2.5、3 h 的胰頭部微循環血流量和假手術組相比較低（P＜0.05）；膽鹽誘導急性胰腺炎組實驗動物在開始0.5、1、1.5、2、2.5、3 h的胰體尾部微循環血流量和假手術組相比較低（P＜0.05）；說明膽鹽誘導急性胰腺炎大鼠可出現胰頭、胰體尾部微循環血流下降，形成微循環血栓；膽鹽誘導急性胰腺炎組大鼠在術后2、4、6、12 h腫瘤壞死因子-α 指標與假手術組相比較高（P＜0.05）；膽鹽誘導急性胰腺炎組大鼠在術后2、4、6、12 h 中白介素-6 指標與假手術組較高（P＜0.05）；說明膽鹽誘導急性胰腺炎大鼠的炎性因子IL-6、TNF-α 急驟增高，引發機體的級聯炎性反應；膽鹽誘導急性胰腺炎組實驗后的血清脂肪酶、血清淀粉酶指標分別為（3 023.2±780.2）、（1 740.7±55.6）U/L與假手術組（86.6±27.2）、（148.7±37.1）U/L 相比較高（P＜0.05），與張順等[18]的研究結果大體一致，張順等研究中急性重癥胰腺炎大鼠的SAP 組實驗前血清淀粉酶（81.5±9.6）、血清脂肪酶（29.5±2.6）U/L；而實驗12 h 后SAP 組的血清淀粉酶為（1 739.2±57.9）、血清脂肪酶為（3 041.9±779.2）U/L（P＜0.05）。本研究說明膽鹽誘導急性胰腺炎的血清脂肪酶、淀粉酶大幅度增高；膽鹽誘導急性胰腺炎組與假手術組相比，胰腺病理學中性粒細胞浸潤、壞死、出血、水腫評分較高（P＜0.05），說明膽鹽誘導急性胰腺炎病理學中性粒細胞浸潤、壞死、出血、水腫等變化。

綜上所述，急性重癥胰腺炎患者胰腺區域血流量大幅度降低，產生微循環障礙，加重病情的炎性因子指標為腫瘤壞死因子-α、白介素-6 指標。