探究士的寧對小鼠皮層神經(jīng)元興奮性的影響

趙曉燕，張勇剛，沈瑞芳，劉淑嬌

1.朔州職業(yè)技術(shù)學院醫(yī)護系，山西朔州 036002；2.朔州職業(yè)技術(shù)學院生物工程系，山西朔州 036002；3.哈爾濱工業(yè)大學空間環(huán)境與物質(zhì)科學研究院，黑龍江哈爾濱 150001

士的寧（strychnine）又名番木鱉堿，是馬錢子中主要的藥理成分[1]，能抗腫瘤、抗炎癥、促進血液循環(huán)，還具有抗疼痛、保護神經(jīng)等多種作用，故具有十分重要的藥用價值[2-3]。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，士的寧對脊髓、延髓與大腦皮層等神經(jīng)中樞均有興奮性作用[4]，通過調(diào)節(jié)生物體Na+電流、K+電流、Ca2+電流等各種電流[5]，或者神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿[6]和甘氨酸[7]等來影響神經(jīng)元的興奮性。神經(jīng)元的興奮性又能夠影響整個神經(jīng)系統(tǒng)的興奮或抑制。已有研究證明，一些神經(jīng)系統(tǒng)類的疾病，如精神病、癲癇、老年癡呆、孤獨癥譜系障礙等疾病的發(fā)生均與神經(jīng)系統(tǒng)的過度興奮和過度抑制有關(guān)[8]。在保持神經(jīng)元靜息電位不變的前提下，研究士的寧對動作電位（action potential, AP）閾值的影響，可以檢測士的寧對神經(jīng)元興奮性的作用。通過研究單個AP 和單位時間內(nèi)AP 發(fā)放個數(shù)，可以進一步探究具體是作用于何種離子而引起興奮性，探討是否對神經(jīng)元有保護作用，所以探究士的寧對神經(jīng)元興奮性的影響具有十分重要的意義。本文選取2019 年6—10 月大連理工大學提供的小鼠皮層神經(jīng)元細胞30 個，采用膜片鉗技術(shù)，以皮層神經(jīng)元細胞為材料，探究士的寧對皮層神經(jīng)元AP 和電壓依賴性K+電流的影響，初步研究士的寧對神經(jīng)興奮性的影響和作用機制。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料

KM 小鼠皮層神經(jīng)元細胞由大連理工大學生命科學院實驗中心提供。

1.2 方法

1.2.1 全細胞膜片鉗記錄 采用5 步拉制法拉制出玻璃微電極，灌注電極內(nèi)液，電極電阻為7～9 MΩ。棄掉培養(yǎng)皿中的舊培養(yǎng)基，加入2 mL 電極外液。通過倒置顯微鏡，找胞體呈錐體形或三角形、表面干凈、有較強反光的神經(jīng)細胞進行實驗。借助三維操縱儀把正壓的玻璃微電極靠近皮層神經(jīng)元，把正壓撤去，向下移動玻璃微電極，使其與皮層神經(jīng)元細胞膜剛剛接觸，通過給予玻璃微電極適當負壓，使其與細胞膜緊密吸附形成高阻封接，接著通過施加快速負壓打破神經(jīng)元細胞膜，形成全細胞膜片鉗記錄模式。

1.2.2 分組與處理 隨機選取6 個小鼠皮層神經(jīng)元細胞形成全細胞膜片鉗記錄。針對每一個皮層神經(jīng)元細胞，在加藥前用膜片鉗記錄的數(shù)據(jù)為對照組，通過MPS-1 加藥系統(tǒng)分別加入0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L 士的寧所得數(shù)據(jù)作為A、B、C、D、E 共5 個實驗組。發(fā)現(xiàn)1、10 μmol/L 士的寧能顯著地抑制動作電位閾值，即可以影響皮層神經(jīng)元興奮性，而0.001、0.01、0.1 μmol/L 士的寧沒有影響，所以后續(xù)不需要再進行研究。士的寧的中毒劑量是5～10 mg[9]，本研究所選的5 個濃度均在安全范圍，1、10 μmol/L士的寧均有作用，但士的寧的安全劑量范圍比較小[10]，故后續(xù)實驗僅選取小劑量D組即1 μmol/L進行研究。

1.3 觀察指標

1.3.1 AP 閾值 采用電流鉗技術(shù)，具體Protocol：將膜電流鉗制在200 pA，給予時程為10 ms 的閾上刺激，記錄加藥前AP 閾值。

1.3.2 AP 上升支和下降支時程 采用電流鉗技術(shù)，具體Protocol：膜電流鉗制在160 pA，給予時程為10 ms 的閾上刺激，誘發(fā)AP，記錄加藥前后AP 上升支和下降支時程。

1.3.3 單個AP 峰值 采用電流鉗技術(shù)，具體Protocol：膜電流鉗制在100 pA，給予時程為500 ms 的閾上刺激，記錄加藥前后單個AP 峰值。

1.3.4 AP 重復發(fā)放頻率 采用電流鉗技術(shù)，具體Protocol：設(shè)置（500 ms，100 pA）的電流鉗制刺激，記錄加藥前后AP 發(fā)放個數(shù)。

1.3.5 電壓依賴性K+電流 采用電壓鉗技術(shù)，具體Protocol：將膜電壓鉗制在-10 mV，先給予一個時程為300 ms，復極化至-100 mV 的刺激，再恢復至-10 mV 后去極化至+40 mV，每10 mV 階躍1 次，時程150 ms。為了排除細胞間的差異，用電流密度（pA/pF）代替電流，計算公式：pA/pF=Imax/Cs（Imax是電流峰值，Cs 為膜電容）。

1.4 統(tǒng)計方法

使用Pulse 和Clamfit 軟件設(shè)置記錄參數(shù)（protocal）、統(tǒng)計和整理數(shù)據(jù)，再使用Origin 軟件繪制統(tǒng)計圖。符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，采用t檢驗分析實驗數(shù)據(jù)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同士的寧濃度間神經(jīng)元細胞的AP 閾值比較

A、B、C 組神經(jīng)元AP 閾值低于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。D、E 組神經(jīng)元AP 閾值低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同士的寧濃度間神經(jīng)元細胞的AP 閾值比較[(±s),mV]

表1 不同士的寧濃度間神經(jīng)元細胞的AP 閾值比較[(±s),mV]

注：t 值、P 值為各組與對照組比較所得檢驗值

組別對照組（n=6）A 組（n=6）B 組（n=6）C 組（n=6）D 組（n=6）E 組（n=6）士的寧濃度（μmol/L）0 0.001 0.01 0.1 1 10 AP 閾值-41.43±1.31-41.51±1.50-41.57±1.59-42.63±1.80-44.30±1.99-46.54±2.41 t 值0.098 0.166 1.320 2.951 4.563 P 值＞0.05＞0.05 0.110 0.008＜0.001

2.2 D 組與對照組神經(jīng)元細胞的AP 時程寬度比較

D 組AP 上升支時程高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），D 組AP 下降支時程高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 D 組與對照組神經(jīng)元細胞的AP 時程寬度比較[(±s),ms]

表2 D 組與對照組神經(jīng)元細胞的AP 時程寬度比較[(±s),ms]

組別對照組（n=6）D 組（n=6）t 值P 值A(chǔ)P 上升支時程2.83±0.21 2.91±0.23 0.629 0.250 AP 下降支時程4.56±0.38 6.02±0.71 4.441＜0.001

2.3 D 組與對照組神經(jīng)元細胞的單個AP 峰值比較

D 組單個AP 峰值低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 D 組與對照組神經(jīng)元細胞的單個AP 峰值比較[(±s),mV]

表3 D 組與對照組神經(jīng)元細胞的單個AP 峰值比較[(±s),mV]

組別對照組（n=6）D 組（n=6）t 值P 值單個AP 峰值30.23±3.76 22.12±2.13 4.597＜0.001

2.4 D 組與對照組神經(jīng)元細胞的AP 個數(shù)比較

D 組AP 個數(shù)少于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 D 組與對照組神經(jīng)元細胞的AP 個數(shù)比較[(±s),個]

表4 D 組與對照組神經(jīng)元細胞的AP 個數(shù)比較[(±s),個]

組別對照組（n=6）D 組（n=6）t 值P 值A(chǔ)P 個數(shù)6.84±1.73 4.52±1.21 2.692 0.012

2.5 D 組與對照組神經(jīng)元細胞的電流密度比較

在膜電位≥-10 mV 時，D 組電流密度呈電壓依賴性地低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表5。

表5 D 組與對照組神經(jīng)元細胞的電流密度比較[(±s),PA/PF]

表5 D 組與對照組神經(jīng)元細胞的電流密度比較[(±s),PA/PF]

膜電位（mV）-10 0 10 20 30 40對照組（n=6）176.72±16.76 255.14±20.37 369.69±21.30 487.41±23.25 627.79±32.47 759.52±44.62 D 組（n=6）130.13±26.95 186.10±25.45 256.60±24.57 325.16±26.63 390.81±30.59 448.02±36.45 t 值3.596 5.188 8.519 11.242 13.012 13.243 P 值0.002＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

3 討論

士的寧作為中樞興奮類藥物，當前對其研究主要集中在神經(jīng)保護機制方面。一些作用于中樞系統(tǒng)類的藥物可以通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程或者離子活動來傳導興奮性或抑制性信號[11-12]。膜片鉗電生理技術(shù)已經(jīng)成熟，故藥理機制的研究越來越多從離子通道著手，所以本文利用全細胞膜片鉗技術(shù)，以新生KM 小鼠皮層神經(jīng)元為材料，通過研究AP 和電壓依賴性K+電流，來探討士的寧對皮層神經(jīng)元的中樞興奮性機制。首先采用電流鉗技術(shù)研究士的寧對單個AP 的閾電位的作用，發(fā)現(xiàn)士的寧能降低閾電位，說明士的寧能興奮皮層神經(jīng)元。Tan T 等[13]研究表明：降低AP 閾值能提高神經(jīng)元興奮性與本研究一致，又因為AP 上升支主要是因為電壓依賴性鈉電流引起[14]，而AP 下降支主要是由電壓依賴性K+電流引起[15]，所以又研究了士的寧對單個AP 時程寬度的影響，發(fā)現(xiàn)士的寧能主要影響AP 下降支時程，對上升支時程沒有影響，所以士的寧降低AP 閾值是因為電壓依賴性K+外流引起。

此外，已有研究表明，一些神經(jīng)保護類藥物可以通過抑制皮層神經(jīng)元電壓依賴性K+，能夠延長單一動作電位下降支時程，減少單位時間內(nèi)動作電位重復發(fā)放頻率，進而發(fā)揮神經(jīng)保護作用[16]。本文研究士的寧對連續(xù)AP 的作用，發(fā)現(xiàn)其能夠降低重復發(fā)放頻率，這也表明士的寧可以興奮皮層神經(jīng)元，對神經(jīng)元細胞具有保護作用，并初步推測士的寧對皮層神經(jīng)元的興奮性主要是通過作用于K+電流來實現(xiàn)的。故本研究又檢測了士的寧對電壓依賴性K+電流的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在膜電位≥-10 mV 時，士的寧能顯著地降低電流密度且呈電壓依賴性，這就證明了上述推測是正確的。類似研究中，以豚鼠心肌細胞為材料，同樣采用膜片鉗技術(shù)研究馬錢子對電壓依賴性K+電流的作用，結(jié)果顯示3 μmol/L 馬錢子使+40 mV 時電流密度由（1.12±0.21）降為（0.95±0.24）（n=6，P＜0.05）[17]，因為馬錢子的主要藥理成分是士的寧[1]，同樣證明士的寧對電壓依賴性K+電流有抑制作用，與本研究結(jié)果基本一致。本研究在40 mV 時電流密度由（759.52±44.62）PA/PF 降為（448.02±36.45）PA/PF（P＜0.05），可能是因為膜片鉗儀器不同、細胞存在差異和具體的刺激Protocol 不一樣引起，但是針對每一個細胞，均是通過加藥前后進行對比，影響趨勢是一致的。

Zlotos DP 等[18]從神經(jīng)遞質(zhì)的釋放過程著手來研究士的寧的中樞興奮作用，其研究顯示小劑量的士的寧能夠與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)-甘氨酸競爭受體結(jié)合，解除抑制，興奮中樞神經(jīng)如大腦皮層感覺中樞，降低感覺神經(jīng)末梢和交感神經(jīng)的興奮閾值，能使昏迷的患者蘇醒過來，與本研究結(jié)果一致。但是已有研究證明士的寧能夠透過血腦屏障[19]，所以本研究著重以皮層神經(jīng)元細胞為直接作用對象，通過膜片鉗技術(shù)研究AP，從離子通道的角度解釋了小劑量士的寧能夠興奮大腦皮層，使昏迷的患者蘇醒[12]。

綜上所述，小劑量士的寧一方面能夠興奮大腦皮層，其作用機制是降低AP 閾值，提高皮層神經(jīng)元興奮性；另一方面小劑量士的寧能夠通過抑制皮層神經(jīng)元電壓依賴性K+電流，減少復極化中K+外流，降低AP 重復發(fā)放頻率，減少能量消耗，保護皮層神經(jīng)細胞。