上調(diào)c-Ski基因表達對青光眼兔術后瘢痕形成及TGF-β、RhoA/Rock信號通路的影響

劉莉莉 招志毅 曾招榮

(廣西醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院柳州市工人醫(yī)院眼科,廣西柳州市 545005)

青光眼是眼壓升高后視覺神經(jīng)受損而導致視力降低的眼科疾病。流行病學調(diào)查顯示,我國青光眼患病人數(shù)超過2 000萬,約占全球患病人數(shù)的28%,以中老年人群多見[1]。臨床上,青光眼的治療以藥物治療和手術治療為主,但部分患者對藥物治療不耐受,須選擇手術治療。其中過濾性手術因具有機械損傷小等優(yōu)點被廣泛應用于臨床。研究顯示,過濾性手術后青光眼病灶出現(xiàn)纖維細胞分化和膠原沉淀,加快濾過道瘢痕形成[2],從而影響眼內(nèi)房水的自然流動,導致眼壓升高,進一步損傷視神經(jīng),最終導致視力喪失。青光眼術后瘢痕形成與多種信號通路有關,轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF)-β通過介導結(jié)締組織形成及細胞生長相關信號表達,在青光眼術后瘢痕形成過程中促進基質(zhì)沉淀[3]。Rho相關激酶(Rho-associated kinase,Rock)是Ras同源家族成員A(Ras homolog family member A,RhoA)激酶,是Rho 家族的鳥苷三磷酸酶主要效應系統(tǒng),其在非神經(jīng)系統(tǒng)中高表達,具有多種生物活性,能夠促進黏附斑形成[4]。正常人視神經(jīng)乳頭中RhoA呈低表達,但是在人工培養(yǎng)的青光眼視神經(jīng)乳頭星形膠質(zhì)細胞中RhoA表達顯著升高,因此我們推測RhoA/Rock信號通路的激活可能導致青光眼視神經(jīng)損傷[5]。c-Ski是TGF-β/Smad信號通路中的負性調(diào)節(jié)因子,其通過干擾Smad蛋白的磷酸化和TGF-β靶基因的激活,抑制組織纖維化,進而減少瘢痕形成[6]。研究顯示,c-Ski可以減少膠原沉積,促進青光眼術后傷口愈合[7],但相關機制尚未清楚。因此,本研究分析上調(diào)c-Ski基因表達對青光眼術后瘢痕形成及TGF-β、RhoA/Rock信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新西蘭大白兔30只,均為雄性,體重2.0～2.5 kg,購自重慶威斯騰生物醫(yī)藥科技有限責任公司[動物生產(chǎn)許可證號:SYXK(渝)2021-0006]。按照實驗動物規(guī)則進行常規(guī)飼養(yǎng),手術前3 d采用CT-800非接觸式眼壓計(TOPCON公司)檢測大白兔雙眼眼壓,確定為正常眼壓后進行常規(guī)眼科檢測,排除其他眼科疾病后進行后續(xù)試驗。

1.2 主要試劑與儀器 c-Ski質(zhì)粒及空白質(zhì)粒由第三軍醫(yī)大學周元國教授贈予;TGF-β1抗體、Rock抗體、RhoA抗體購自Abcam公司(批號:gr3252552-1、gr3211461-5、gr198717/24);HE染色試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司(批號:1902250101);TRIzol試劑購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司(批號:LM-0010);RIPA裂解緩沖液購自上海創(chuàng)賽科技有限公司(批號:PM12142);二喹啉甲酸試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司(批號:20180501);電化學發(fā)光液購自上海碧云天生物技術有限公司(批號:P0018FM);多聚甲醛購自江蘇普樂司生物科技有限公司(批號:20130104)。KM1-DYCZ-24蛋白電泳儀購自北京六一生物科技有限公司;VT1200S振動切片機購自Leica Biosystems公司;Stemi-508光學顯微鏡購自美谷生物科技(浙江)有限公司。

1.3 建模方法和手術方法

1.3.1 青光眼兔模型的建立:所有大鼠均取右眼進行實驗。造模前1 d采用氯霉素滴眼進行清潔消毒,1～2次/d。造模時,給予0.15 mL/kg速眠新肌肉注射進行麻醉,并給予眼部表面麻醉,用氯霉素沖洗結(jié)膜囊,于9:00方位沿角鞏膜緣內(nèi)1 mm用注射器刺入前房,抽出房水0.2 mL,然后在相同位置注入1%甲基纖維素0.1 mL。術后2 d持續(xù)監(jiān)測眼壓,兔眼壓>24 mmHg(1 mmHg≈0.133 kPa)表明模型構(gòu)建成功。本研究所有大白兔均造模成功。

1.3.2 青光眼兔濾過手術:造模成功后,給予0.15 mL/kg速眠新肌肉注射進行麻醉,然后用氯霉素沖洗結(jié)膜囊,以鼻上端角膜緣為底部制作結(jié)膜瓣,暴露鞏膜,做4 mm×3 mm、深度達1/2鞏膜厚度的鞏膜切口,用鑷子夾住角鞏膜深層組織的游離邊緣向后翻轉(zhuǎn),然后用剪刀剪除角鞏膜深層組織1.5 mm×1 mm或2 mm×1.5 mm,使用金霉素眼膏和阿托品眼膏涂抹患眼,術后滴用氯霉素眼藥水,1～2滴/次,1～2次/d,連續(xù)使用3 d。本研究所有大白兔均順利完成手術。

1.4 動物分組及處理 將30只青光眼兔隨機分為A組、B組、C組、D組和E組,每組6只。術后3 d后,C組、D組和E組均在術眼結(jié)膜下分別注射100 μg c-Ski質(zhì)粒、200 μg c-Ski質(zhì)粒、400 μg c-Ski質(zhì)粒,B組在術眼結(jié)膜下注射400 μg空白質(zhì)粒,A組在術眼結(jié)膜下注射0.5 mL PBS。

1.5 眼壓檢測 分別于造模前及術后2 d、4 d、7 d、14 d、28 d,采用CT-800非接觸式眼壓計分別檢測各組兔眼壓,重復檢測3次,取平均值。

1.6 濾過道組織中Ⅰ型和Ⅱ型膠原面積的檢測 術后2 d、4 d、7 d、14 d、28 d,取各組兔適量濾過道組織制作石蠟切片,常規(guī)脫蠟、脫水后,采用PBS沖洗3次,5 min/次,37 ℃下用羊血清封閉60 min,加入一抗,4 ℃下孵育24 h,加入二抗,37 ℃下孵育30 min,沖洗后加入50 μL鏈霉親和素-生物素復合物,用二氨基聯(lián)苯胺顯色,沖洗,終止顯色,透明、封片。將切片置于光學顯微鏡下,隨機選擇不重疊的5個高倍鏡視野,采用Image-Pro Plus軟件分析濾過道組織中Ⅰ型膠原面積占比和Ⅱ型膠原面積占比,即Ⅰ型膠原或Ⅱ型膠原面積與濾過道組織面積的比值,取平均值。

1.7 實時熒光定量PCR檢測濾過道組織中c-Ski、TGF-β1、Rock、RhoA 的mRNA表達水平 術后28 d,取各組兔濾過道組織100 g,用眼科無菌剪剪碎,研磨,過100目篩。加入胰蛋白酶進行消化,取細胞重懸液,用Tween-Tris緩沖鹽水沖洗3次,5 min/次,然后置于無菌試管,采用TRIzol試劑提取總RNA,采用紫外分光光度計法測定RNA濃度,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后,以cDNA為模板,進行實時熒光定量PCR。PCR的反應體系:SYBR Green PCR Master Mix(2×)12.5 μL,上游引物(10 μmol/L)1 μL,下游引物(10 μmol/L)1 μL,模板cDNA 2 μL,加入ddH2O至總體積為25 μL。引物序列見表1。PCR的反應條件:98 ℃預變性6 min;98 ℃變性28 s,75 ℃退火30 s,80 ℃延伸4 min,共55個循環(huán)。

表1 不同時間點各組兔眼壓的比較(x±s,mmHg)

表1 引物序列

1.8 HE染色觀察濾過道組織病理學表現(xiàn) 術后28 d取各組兔濾過道組織,使用10%甲醛溶液固定1 d,并使用10%乙二胺四乙酸進行脫鈣處理,12 d后取出,經(jīng)過梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片后,加入1%二甲苯和純酒精混合液浸泡6 min,采用堿性蘇木精染色10 min后,采用PBS沖洗過多的染液,然后用80%酒精分化處理15 min,用PBS充分沖洗后,用0.5%酸性伊紅染色5 min,用PBS透明2次后,在顯微鏡下進行觀察。

1.9 Western blot檢測濾過道組織中TGF-β1、Rock、RhoA的蛋白表達水平 術后28 d取各組兔濾過道組織,采用RIPA裂解緩沖液進行裂解,提取總蛋白,采用二喹啉甲酸試劑盒檢測總蛋白濃度,將蛋白溶液和緩沖溶液按照4 ∶1的比例混勻后煮沸,使蛋白質(zhì)變性,4 ℃下以12 000 r/min離心10 min,取上清液加入上樣孔,進行SDS-PAGE分離蛋白,然后通過電轉(zhuǎn)印將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜,采用Tris緩沖鹽溶液浸泡PVDF膜10 min,用PBS反復沖洗后,分別加入一抗TGF-β1、Rock及RhoA抗體(稀釋比例均為1 ∶500)各20 μL/mL,4 ℃孵育過夜。用TBST洗滌3次,5 min/次,然后加入20 μL的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗(稀釋比例為1 ∶500),雜交5 min后采用PBS沖洗3次,5 min/次,然后放入電化學發(fā)光液中,用二氨基聯(lián)苯胺顯色后照相。用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值,以GAPDH(稀釋比例均為1 ∶5 000)為內(nèi)參,計算目的蛋白的相對表達水平。

1.10 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示,多組間比較采用方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗;重復測量資料的比較采用重復測量方差分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同時間點各組兔眼壓的比較 主效應分析結(jié)果顯示,5組兔眼壓差異具有統(tǒng)計學意義(F組間=105.900,P組間<0.001),5組兔眼壓有隨時間變化的趨勢(F時間=1 020.000,P時間<0.001)。兔眼壓的分組與時間有交互效應(F交互=47.950,P交互<0.001),故應對兔眼壓進一步行分組因素和時間因素的單獨效應分析。結(jié)果顯示,術后2 d、4 d、7 d、14 d、28 d,與A組及B組比較,C組、D組、E組兔眼壓均降低,與C組比較,D組和E組兔眼壓均降低(均P<0.05)。隨著術后時間的延長,5組兔眼壓總體呈升高趨勢。見表1。

2.2 術后各組兔濾過道組織中Ⅰ型和Ⅱ型膠原面積占比的比較 主效應分析結(jié)果顯示,5組兔Ⅰ型膠原面積占比差異具有統(tǒng)計學意義(F組間=258.700,P組間<0.001),5組兔Ⅰ型膠原面積占比有隨時間變化的趨勢(F時間=141.100,P時間<0.001)。Ⅰ型膠原面積占比的分組與時間有交互效應(F交互=3.815,P交互<0.001),故應對兔Ⅰ型膠原面積占比進一步行分組因素和時間因素的單獨效應分析。結(jié)果顯示,術后2 d、4 d、7 d、14 d、28 d,與A組及B組比較,C組、D組、E組兔Ⅰ型膠原面積占比均降低,且C組、D組、E組兔Ⅰ型膠原面積占比依次降低(均P<0.05)。隨著術后時間的延長,5組兔Ⅰ型膠原面積占比逐漸升高。見表2。

表2 術后各組兔濾過道組織中Ⅰ型膠原面積占比的比較(x±s,%)

主效應分析結(jié)果顯示,5組兔Ⅱ型膠原面積占比差異具有統(tǒng)計學意義(F組間=45.280,P組間<0.001),5組兔Ⅱ型膠原面積占比有隨時間變化的趨勢(F時間=6.694,P時間<0.001)。Ⅱ型膠原面積占比的分組與時間有交互效應(F交互=6.694,P交互<0.001),故應對兔Ⅱ型膠原面積占比進一步行分組因素和時間因素的單獨效應分析。結(jié)果顯示,術后14 d,與A組及B組比較,C組、D組、E組兔Ⅱ型膠原面積占比均降低,且C組、D組、E組兔Ⅱ型膠原面積占比依次降低(均P<0.05)。隨著術后時間的延長,5組兔Ⅱ型膠原面積占比先升高后降低。見表3。

表3 術后各組兔濾過道組織中Ⅱ型膠原面積占比的比較(x±s,%)

2.3 術后28 d各組兔濾過道組織中c-Ski、TGF-β1、Rock及RhoA mRNA表達水平的比較 與A組和B組相比,C組、D組、E組兔濾過道組織中c-Ski mRNA表達水平升高,TGF-β1、Rock及RhoA mRNA表達水平均降低,且C組、D組、E組c-Ski mRNA表達水平依次升高,TGF-β1、Rock及RhoA mRNA表達水平依次降低(均P<0.05)。見表4。

表4 術后28 d各組兔濾過道組織中c-Ski、TGF-β1、Rock及RhoA mRNA相對表達水平的比較(x±s)

2.4 術后28 d各組兔濾過道組織的病理學表現(xiàn) 術后28 d,在A組和B組的濾過道組織中可見大量膠原纖維,組織排列紊亂,炎癥細胞浸潤;在C組、D組和E組濾過道組織中膠原纖維減少,組織排列及邊界清晰,炎癥細胞浸潤減少,無新生膠原纖維。見圖1。

圖1 各組兔濾過道組織的病理學表現(xiàn)(HE染色,×200)

2.5 術后28 d各組兔濾過道組織中TGF-β1、Rock及RhoA蛋白表達水平的比較 與A組和B組相比,C組、D組、E組兔濾過道組織中TGF-β1、Rock及RhoA蛋白表達水平降低,且C組、D組、E組上述蛋白表達水平依次降低(均P<0.05)。見表5和圖2。

圖2 各組兔濾過道組織中TGF-β1、Rock及RhoA蛋白電泳圖

表5 術后28 d各組兔濾過道組織中TGF-β1、Rock及RhoA 蛋白相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

外科手術是治療青光眼患者的有效方法,而濾過性手術后瘢痕形成是導致手術失敗的主要原因[8]。青光眼術后瘢痕形成與眼壓升高、眼部組織損傷、炎癥細胞及成纖維細胞增多有關[9]。成纖維細胞活性增強會加快膠原蛋白合成,導致濾過道瘢痕形成[10]。成纖維細胞自身還可分泌Ⅰ型膠原,Ⅰ型膠原沉積是瘢痕組織纖維化的基礎[11]。c-Ski基因廣泛存在于胚胎組織,參與細胞生長的調(diào)節(jié)及信號因子的轉(zhuǎn)移[12]。有研究顯示,c-Ski的過表達能夠促進細胞增殖,有利于組織創(chuàng)傷修復[13]。然而c-Ski具有多重生物活性,對纖維細胞的作用較復雜,上調(diào)c-Ski表達能夠降低眼壓及Ⅰ型膠原面積占比,且呈劑量依賴性[14],還能減少炎癥因子的分泌,穩(wěn)定濾過泡,具有改善青光眼病情的作用[15]。c-Ski的過表達還能夠減少纖維增生及Ⅰ型膠原合成,達到治療青光眼的目的[16],這可能與上調(diào)c-Ski基因能夠通過阻止Smad2/3信號轉(zhuǎn)錄,抑制濾過道瘢痕形成有關[17]。本研究結(jié)果顯示,術后2 d、4 d、7 d、14 d、28 d,C組、D組及E組兔眼壓均低于A組和B組,D組和E組兔眼壓均低于C組(均P<0.05),E組兔眼壓略低于D組,但兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與A組和B組相比,C組、D組、E組Ⅰ型膠原面積占比降低,且C組、D組、E組Ⅰ型膠原面積占比依次降低(均P<0.05)。提示術后兔眼壓水平、Ⅰ型膠原面積占比與c-Ski的表達水平總體上呈現(xiàn)負相關。而術后2 d、4 d、7 d、28 d,各組兔濾過組織中Ⅱ型膠原蛋白面積占比差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05),這可能與Ⅱ型膠原在青光眼術后濾過道組織中的占比較小、作用較弱[18]有關。上述結(jié)果說明上調(diào)c-Ski表達能降低青光眼兔術后的眼壓,減少膠原合成,對青光眼術后瘢痕的形成有抑制作用,并呈現(xiàn)濃度依賴性。這與Pokrajac等[19]的研究結(jié)果相似。

研究顯示,青光眼患者房水TGF-β1水平升高,TGF-β1能夠促進纖維細胞生成,參與傷口愈合過程[20]。青光眼術后,TGF-β1能夠調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)(如纖維連接蛋白),促進青光眼術后瘢痕形成[21],而TGF-β1受體能夠激活Smad3發(fā)生磷酸化,抑制瘢痕愈合[22]。有學者認為,降低TGF-β1活性能夠抑制青光眼大鼠纖維細胞增殖和瘢痕形成[23]。RhoA是一種鳥苷三磷酸酶,在循環(huán)系統(tǒng)中發(fā)揮信號通路開關的作用。除對纖維細胞有調(diào)節(jié)作用外,RhoA還參與細胞黏附及細胞遷移。Rock屬于蛋白激酶,在接收到RhoA信號后其表達水平升高并參與氨基酸磷酸化,調(diào)節(jié)細胞運動[24]。近年有學者指出,RhoA/Rock信號通路參與纖維化病變的發(fā)生過程,在青光眼術后瘢痕中RhoA和Rock mRNA表達水平升高,表明RhoA/Rock參與瘢痕的發(fā)生和發(fā)展[25]。Liu等[26]的研究顯示,TGF-β1能夠刺激RhoA/Rock蛋白表達,促進瘢痕形成,RhoA/Rock信號通路有可能成為治療瘢痕的靶點之一。本研究結(jié)果顯示,與A組和B組相比,C組、D組、E組兔濾過道組織中TGF-β1、Rock及RhoA 的mRNA和蛋白表達水平均降低,且C組、D組、E組的上述指標依次降低(均P<0.05)。說明上調(diào)c-Ski表達能抑制RhoA、Rock和TGF-β1的表達,進而改善青光眼術后瘢痕形成。

本研究存在一定局限性,如未建立空白對照組、RhoA/Rock和TGF-β1抑制劑組進行對照分析,c-Ski干預時間及干預次數(shù)還需要完善。今后還應進一步完善實驗方法。

綜上所述,上調(diào)c-Ski基因表達能夠降低青光眼兔術后的眼壓,減少膠原合成,抑制瘢痕形成,這可能與其抑制TGF-β1及RhoA/RocK信號通路有關。