PHH3改良計(jì)數(shù)方法在核分裂計(jì)數(shù)中的應(yīng)用價(jià)值

張占蛟,徐中海,章珊,張雪蓮 （南京金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所,江蘇 南京 210000）

胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumors，GIST）經(jīng)常與其他惡性腫瘤同時(shí)發(fā)生，大多數(shù)病例為腺癌[1]。由于GIST和脂肪肉瘤都是間質(zhì)性起源，所以它們的共存非常罕見。GIST的診斷大多依據(jù)影像學(xué)檢查如計(jì)算機(jī)斷層掃描和MRI、內(nèi)窺鏡和組織活檢[2]，然而，影像學(xué)檢查結(jié)果大多不具備特異性，而最終確診往往需要組織標(biāo)本病理學(xué)檢查。

磷酸化組蛋白H3（Phospho-histone H3，PHH3）是細(xì)胞質(zhì)核心染色質(zhì)的重要組成之一，其在有絲分裂的早期、中期、后期與末期的核分裂象均呈陽性表達(dá)，而在分裂間期及核固縮、核碎裂均不表達(dá)。它是研究細(xì)胞核有絲分裂特異性較高的抗體之一，近年來被用于研究和腫瘤核分裂相關(guān)的一些項(xiàng)目。然而，筆者在實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)，PHH3的陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)要遠(yuǎn)高于HE染色下核分裂計(jì)數(shù)。分析原因，考慮是PHH3染色存在某些未知的細(xì)胞非特異著色，從而造成計(jì)數(shù)遠(yuǎn)高于實(shí)際核分裂數(shù)，而人工在HE下計(jì)數(shù)核分裂，僅計(jì)數(shù)形態(tài)明確的核分裂[3]，由此造成了計(jì)數(shù)差異，那么，PHH3這個(gè)抗體對于病理醫(yī)生到底還有沒有幫助呢？本文選取胃腸道間質(zhì)瘤作為實(shí)驗(yàn)對象，進(jìn)一步明確這一抗體在實(shí)驗(yàn)中的作用。

本文收集了南京金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所2019年1月-2021年12月期間進(jìn)行病理檢查的胃腸道間質(zhì)瘤患者52例為研究對象，同時(shí)在HE下和PHH3標(biāo)記下進(jìn)行核分裂計(jì)數(shù)，并進(jìn)行比較。以明確PHH3對于臨床病理醫(yī)生核分裂計(jì)數(shù)是否有所幫助，以此增加準(zhǔn)確度、減輕工作量、縮短工作時(shí)間。與以往計(jì)算PHH3陽性細(xì)胞數(shù)不同的是，本次研究僅計(jì)數(shù)PHH3陽性細(xì)胞內(nèi)可明確辨認(rèn)為核分裂的細(xì)胞。以此過濾掉一些非特異著色，增加準(zhǔn)確度。此研究為回顧性分析，不涉及患者姓名、年齡等隱私信息，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 收集南京金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所2019年1月-2021年12月期間進(jìn)行病理學(xué)檢查的胃腸道間質(zhì)瘤患者52例為研究對象，其中低度危險(xiǎn)性42例，中度危險(xiǎn)性8例，高度危險(xiǎn)性2例，采用隨機(jī)的方法進(jìn)行排列。同一腫瘤組織分別進(jìn)行HE染色和PHH3免疫組化標(biāo)記，計(jì)算兩種不同染色方法下核分裂數(shù)和觀測時(shí)間并進(jìn)行比較。

1.2 方法 標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片厚度4微米。裱貼于防脫片玻片上，PHH3抗體及二抗、DAB顯色劑均采用邁新生物試劑。免疫組化方法采用En Vision兩步法，高壓鍋抗原修復(fù)。免疫組化操作人員為資深病理技術(shù)員，有多年的免疫組化制片經(jīng)驗(yàn)[4]。所有病例在核分裂計(jì)數(shù)時(shí)均用了PHH3進(jìn)行標(biāo)記，并且每例標(biāo)本均經(jīng)過3位資深病理醫(yī)生于高倍鏡下分別計(jì)數(shù)5mm2視野的核分裂數(shù)，計(jì)算其平均值。同時(shí)分別記錄HE和PHH3的閱片時(shí)間，并計(jì)算平均閱片時(shí)間[5]。所有數(shù)據(jù)經(jīng)jamovi軟件分析，計(jì)算PHH3和HE下核分裂的數(shù)量及平均時(shí)間，并對二者進(jìn)行比較，分析其相關(guān)性。

1.3 結(jié)果判讀 由于目前GIST的核分裂計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為HE下人工計(jì)數(shù)，通常僅能辨認(rèn)明確的有絲核分裂（見圖1），故計(jì)數(shù)PHH3標(biāo)記的核分裂數(shù)時(shí)僅計(jì)算形態(tài)明確的有絲核分裂（見圖2），而不是計(jì)數(shù)所有陽性細(xì)胞（見圖3），因?yàn)槟菢訉?dǎo)致GIST危險(xiǎn)度升級，可能給患者帶來過度治療，影響身體健康，同時(shí)給患者增加不必要的經(jīng)濟(jì)支出。

圖1 HE下核分裂

圖2 PHH3下核分裂

圖3 PHH3下非特異陽性細(xì)胞

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)經(jīng)jamovi軟件分析，計(jì)數(shù)5mm2視野的核分裂數(shù)，計(jì)算其平均值，同時(shí)分別記錄HE和PHH3的閱片時(shí)間，并計(jì)算平均閱片時(shí)間。計(jì)算PHH3和HE下核分裂的數(shù)量及平均時(shí)間，并對二者進(jìn)行比較，分析其相關(guān)性。計(jì)量資料采用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，雙側(cè)P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PHH3和HE下核分裂數(shù)的相關(guān)性分析 假設(shè)HE下核分裂≠PHH3下核分裂，PHH3下核分裂計(jì)數(shù)和HE總體一致（P＞0.05），沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性，PHH3可以用于核分裂計(jì)數(shù)。

2.2 PHH3和HE計(jì)數(shù)核分裂所用時(shí)間的比較分析，PHH3下核分裂計(jì)數(shù)所用時(shí)間相比HE下所用時(shí)間減少了131%。

2.3 經(jīng)過PHH3染色計(jì)數(shù)核分裂后重新評估危險(xiǎn)度，與HE下危險(xiǎn)度前后一致。

3 討論

胃腸道間質(zhì)瘤（GIST）是獨(dú)立起源于胃腸道間質(zhì)干細(xì)胞的腫瘤，屬于消化道間葉性腫瘤，發(fā)病率10/100萬-20/100萬，年齡多在40歲以上，中位年齡為50-60歲，男女發(fā)病率相當(dāng)，但有些報(bào)道提示男性發(fā)病率略高，兒童少見[6]。GIST的確診最終需病理切片及免疫組化的結(jié)果。其治療方式主要為手術(shù)治療及靶向藥物治療（口服的小分子酪氨酸激酶抑制劑——格列衛(wèi)），其預(yù)后取決于腫瘤的危險(xiǎn)度、大小、生長位置、有無轉(zhuǎn)移等。而GIST危險(xiǎn)度的判斷，目前標(biāo)準(zhǔn)為計(jì)數(shù)5mm2核分裂數(shù)，再結(jié)合腫瘤的大小、有無自發(fā)破裂、壞死等來綜合判定[7]。在更好的計(jì)數(shù)方法出現(xiàn)以前，人工在顯微鏡下數(shù)核分裂是主要的方法，其不僅用時(shí)較長，且容易視覺疲勞，容易漏數(shù)。

PHH3改良計(jì)數(shù)方法的簡便性及省時(shí)性不僅可以用于GIST的診斷，還可以用于所有需要觀測腫瘤核分裂的場景中，如神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、乳腺浸潤性導(dǎo)管癌等涉及到病理分級分期的診斷中，在一些軟組織腫瘤的診斷中，核分裂的多少甚至關(guān)系到良惡性或惡性程度的診斷，其雖然不如其他免疫組化抗體在診斷中起著一些關(guān)鍵性的作用，但仍然給病理醫(yī)生的診斷工作帶來了很大的便利性和直觀性[8]。

磷酸化組蛋白H3（Phospho-histone H3，PHH3）是新近發(fā)現(xiàn)的五個(gè)核心組蛋白之一，在真核細(xì)胞中與其他組蛋白構(gòu)成染色質(zhì)中的主要蛋白組分[9]。PHH3在有絲分裂的G2期及M期達(dá)到最大值，因此被認(rèn)為是一種特異性的核分裂標(biāo)志物。磷PHH3抗體被認(rèn)為是細(xì)胞增殖的生物標(biāo)志物，對有絲分裂中的細(xì)胞具有特異性，在不同惡性腫瘤中具有預(yù)后價(jià)值，但在胃腸道間質(zhì)瘤（GIST）中的研究很少[10]。本研究主要對同一腫瘤組織分別進(jìn)行HE染色和PHH3免疫組化標(biāo)記，計(jì)算兩種不同染色方法下核分裂數(shù)和觀測時(shí)間并進(jìn)行比較，以評估PHH3改良計(jì)數(shù)方法在核分裂計(jì)數(shù)中的作用。應(yīng)用PHH3的改良計(jì)數(shù)方法得到的核分裂數(shù)和HE下核分裂數(shù)基本一致，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，同時(shí)可以節(jié)約大量時(shí)間。因此筆者認(rèn)為，PHH3這一抗體應(yīng)用于臨床病理工作可以為病理醫(yī)生節(jié)約大量時(shí)間，并減少漏數(shù)幾率，提高核分裂計(jì)數(shù)精確度，但要注意精確識別核分裂才可納入計(jì)數(shù)范圍。

目前PHH3已經(jīng)被證實(shí)對確定腫瘤細(xì)胞的核分裂象，區(qū)分核分裂象和凋亡小體、核碎片非常有用[11-12]。目前PHH3下計(jì)數(shù)核分裂時(shí)僅觀察明確的有絲分裂，而不是計(jì)算所有的陽性細(xì)胞，這給計(jì)算機(jī)閱片計(jì)數(shù)帶來技術(shù)上的困難，對于計(jì)算所有陽性細(xì)胞的診斷標(biāo)準(zhǔn)仍然需要更多的樣本量及更多的研究來確定[13-14]。PHH3改良計(jì)數(shù)方法在臨床病理診斷工作中用于核分裂計(jì)數(shù)，其不僅計(jì)數(shù)準(zhǔn)確、不易漏數(shù)，且用時(shí)遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于常規(guī)HE下計(jì)數(shù)方法，給臨床病理醫(yī)生節(jié)省了很大的時(shí)間成本，可以在病理實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。