B淋巴細胞瘤-2關聯永生基因3蛋白、多重腫瘤抑制基因1在宮頸癌癌前病變中表達及聯合液基細胞學檢查的臨床意義

杜曉琴，馬瑛，謝剛，陳麗娟，潘長清，張勇

作者單位：電子科技大學醫學院附屬綿陽醫院·綿陽市中心醫院婦產科，四川 綿陽 621000

宮頸癌是臨床上一種常見的惡性腫瘤，流行病學研究提示［1］，近幾年宮頸癌的發病年齡呈現顯著的下降趨勢，呈現顯著的低齡化趨勢，對于女性的生命安全以及生命質量造成嚴重的威脅［2］。目前已經證實［3］，機會性感染高危型人乳頭狀瘤病毒是造成宮頸癌的重要危險因素，隨著病毒對病灶部位的不斷侵染，病灶部位的病變逐步由癌前病變向腫瘤進行發展，所以早期對宮頸癌的癌前病變進行診斷，對于病人的預后具有積極的意義［4］。B 淋巴細胞瘤-2 關聯永生基因3（BAG3）BAG 基因是腫瘤細胞凋亡的抑制性因素，該系列的基因對于多功能的結合蛋白的分泌功能的顯著調節作用，進一步對腫瘤細胞的增殖周期進行調控［5］。多重腫瘤抑制基因1（P16）蛋白通過對腫瘤細胞周期蛋白D1 的特異性結合，進一步對腫瘤細胞的顯著抑制［6］，阻礙腫瘤細胞的進展。本研究主要通過BAG3蛋白、P16在宮頸癌癌前病變病人中表達及聯合液基細胞學檢查的臨床意義分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇綿陽市中心醫院2015 年6 月至2017 年6 月在婦科門診篩查并經陰道鏡宮頸活檢確診的120 例宮頸病變病人為研究對象，病人年齡（37.56±2.69）歲，根據其病變情況分為癌前病變組和宮頸癌組。其中，癌前病變組69 例，年齡（37.36±2.63）歲，身體質量指數（24.34±2.03）kg/m2，宮頸上皮內瘤變Ⅰ級（CINⅠ）15 例， CINⅡ 20 例、CINⅢ 34 例；宮頸癌組51 例，年齡（37.76±3.27）歲，體質量指數（24.76±2.24）kg/m2，宮頸癌的國際婦產科聯盟FIGO 分期：Ⅰ~Ⅱ期23 例，Ⅲ~Ⅳ期28 例，病理類型：鱗癌34 例，腺癌17 例。兩組年齡、身體質量指數等一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有臨床可比性。

病人或其近親屬對研究方案簽署知情同意書。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

宮頸癌病人的納入標準：①均符合宮頸癌診斷標準［7］；②不存在其他原發性腫瘤；③病人的卡式評分均在60 分以上［8］。排除標準：①精神異常；②無法正常溝通；③哺乳期或妊娠期；④其他生殖系統疾病。癌前病變病人納入標準：①經人乳頭瘤病毒檢查確診為宮頸癌前病變；②出現白帶異常、宮頸糜爛等表現；③性生活后有出血。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集所有檢測指標均定期進行室間質控以及室內質控，保證檢測指標的穩定性以及準確性。使用棉簽于病人的宮頸口部位進行逆時針刮取采樣，采樣取3 次，停留時間為10 s，將樣本置于細胞保存液的收集瓶中進行保存。

1.2.2 樣本處理宮頸組織細胞樣本經液基細胞學檢測 采用液基薄層細胞自動制片機（新順國際有限公司，Autocyteprep）對以上樣本進行檢測。將以上樣本進行3 500 r/min 離心15 min 后，使用樣本吸取機對樣本進行混懸，隨后使用比重液對病人的以上混懸液繼續離心，使用樣本吸取機對富集于試管底部的細胞進行收集，并在振蕩器的作用下，重新使細胞處于混懸狀態。將以上液體置于液基薄層細胞自動制片機中，在液基薄層細胞自動制片機進行巴氏染色，染色結束后，對以上玻片進行二甲苯處理后，保證玻片的濕潤狀態，使用中性樹膠進行封固。

1.2.3 BAG3 蛋白、P16 水平檢測將以上樣本進行研磨后，采用二甲苯漂洗15 min，采用95%的乙醇進行漂洗2 次，漂洗時間設定為3 min，使用80%的乙醇溶液進行漂洗3 min，蒸餾水漂洗3 min，使用蘇木精染色5 min，使用流水洗去染色，1%的鹽酸乙醇洗滌3 s，蒸餾水洗3 s，使用80%的乙醇溶液進行漂洗3 s，使用95%的乙醇溶液進行漂洗3 s，使用100%的乙醇溶液進行漂洗3 s，中性樹膠進行封片。將上述膠片使用過氧化物酶阻斷溶液進行浸泡50μL，室溫下孵育時間為10 min，使用磷酸緩沖鹽溶液進行沖洗3 次，每次沖洗時間設定為3 min，去掉磷酸緩沖鹽溶液后，再次對膠片進行正常非免疫動物血清進行室溫孵育，孵育時間設定為10 min，再次去除血清后，使用BAG3、P16血清單抗進行檢測，在400 倍顯微鏡下對病人的膠片進行觀察，在觀察過程中，取5 個視野，在每個視野對計數100 個腫瘤細胞，根據染色深度進行評價，沒有染色為0 分，染色為淡黃色則為1 分，染色為棕黃色則為2 分，染色為黃褐色則為3分，陽性細胞的比例：病人的陽性細胞的比例在5%以下則為0分，陽性細胞的比例在5%~25%則為1 分，陽性細胞的比例在26%~50%則為2分，陽性細胞的比例在51%~75%則為3 分，陽性細胞的比例在76%~100%則為4 分，以染色情況以及陽性細胞的比例的乘積作為病人的BAG3、P16的表達量［9］。所有檢測指標均定期進行室間質控以及室內質控，保證檢測指標的穩定性以及準確性。

1.3 觀察指標觀察癌前病變組以及宮頸癌組BAG3、P16 水平。觀察不同嚴重程度宮頸病變病人的BAG3、P16水平。CINⅠ為輕度非典型增生，細胞異型性低，排列不整齊，但仍保持極性，異常增生的宮頸細胞僅限于上皮層的下1/3；CINⅡ為中度非典型增生，細胞異型性較為明顯，排列紊亂，異常增生的宮頸細胞占上皮層的下2/3；CINⅢ為重度非典型增生，細胞異型性明顯，極性消失，異常增生的宮頸細胞占上皮層的下2/3以上。

1.4 統計學方法數據分析采用SPSS 23.0 進行，正態分布的計量資料以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗比較，三組間比較采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，BAG3、P16 水平與液基細胞學檢查的聯合檢測對宮頸癌癌前病變的診斷效能進行分析，分別計算靈敏度、特異度、符合率、陽性預測值和陰性預測值，宮頸癌癌前病變診斷效能評價采用受試者操作特征曲線（ROC 曲線），曲線下面積（AUC）比較采用Z檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組BAG3、P16 水平比較宮頸癌組BAG3、P16 水平顯著高于癌前病變組，差異有統計學意義。見表1。

表1 宮頸病變120例B淋巴細胞瘤-2關聯永生基因3（BAG3）蛋白、多重腫瘤抑制基因1（P16）水平比較/

表1 宮頸病變120例B淋巴細胞瘤-2關聯永生基因3（BAG3）蛋白、多重腫瘤抑制基因1（P16）水平比較/

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2.2 不同嚴重程度宮頸癌癌前病變病人的BAG3、P16水平比較不同嚴重程度宮頸癌癌前病變病人的BAG3、P16 水平之間的差異有統計學意義，經兩兩比較，病人的BAG3、P16 水平從低到高為CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組。見表2。

表2 不同程度宮頸癌癌前病變B淋巴細胞瘤-2關聯永生基因3（BAG3）蛋白、多重腫瘤抑制基因1（P16）比較/

表2 不同程度宮頸癌癌前病變B淋巴細胞瘤-2關聯永生基因3（BAG3）蛋白、多重腫瘤抑制基因1（P16）比較/

注：①與CINⅠ組比較，P<0.05。②與CINⅡ組比較，P<0.05。

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2.3 聯合檢測效能分析聯合診斷對于宮頸癌癌前病變的診斷特異度、準確率、陽性預測值、陰性預測值均顯著高于單獨檢測（P<0.05）。見表3。

表3 聯合檢測效能分析

2.4 ROC 曲線分析通過ROC 曲線分析結果發現聯合檢測對于宮頸癌癌前病變的診斷ROC 曲線下面積顯著高于單獨檢測，聯合診斷與 BAG3 比較，Z=4.13，P<0.001；聯合診斷與 P16 比較，Z=3.76，P=0.008；聯合診斷與液基比較，Z=3.03，P=0.022。見表4。

表4 聯合檢測對于宮頸癌癌前病變的診斷ROC曲線分析

3 討論

宮頸癌是臨床較為常見的女性惡性腫瘤之一，流行病學調查顯示［10］，我國每年的新發宮頸癌的病例在13 萬以上，其中死亡病例在3 萬以上，其發病率以及死亡率呈現逐年上升的趨勢，同時從年齡的構成上比較，宮頸癌病人的年齡呈現顯著的年輕化趨勢。在宮頸癌疾病的進展中，疾病的進展較為緩慢，具有明顯的癌前病變特征［11］，所以在臨床診斷中，通過對病人的特異性診斷，顯著提升宮頸癌以及宮頸癌前病變的診斷準確性，對于臨床早期開展干預具有積極的意義。而在常規的診斷中，通常采取液基細胞學檢查，但是已有報道［12］指出，其對宮頸癌的癌前病變的診斷具有一定的局限性，所以在臨床診斷中，通過多種靈敏度較高的指標診斷，對于提升對癌前病變的診斷具有積極的意義［13］。P16蛋白由腫瘤抑制基因CDKN2A 在9 號染色體編碼，作用是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，P16INK4a的過度表達可作為一個致癌型HPV 病毒破壞細胞周期的替代標志物，所以在機體的病變組織的分析中，隨著機體的P16蛋白被特異性受體的結合，病人的P16 呈現下降的趨勢［14］。隨著機體P16 水平的下降，機體的腫瘤細胞增殖周期顯著激活，對于腫瘤細胞的進一步浸染具有重要作用［15］。以往的研究已經證實，雖然P16INK4a 彌漫的染色主要與CINⅡ（75.5%~100%）和CINⅢ（100%）有關，然而值得注意的是，大約50%以上的CINⅠ也有強的P16INK4a表達［12］。但是單獨通過對病人的P16表達水平的檢測，并不能對病人的疾病進展進行診斷，需要與多種指標的聯合診斷，以期提高對宮頸癌的診斷效能。劉峰等［13］通過對宮頸癌病人的P16 水平的分析，病人的P16 水平顯著上升，與本研究結果一致。BAG3 蛋白廣泛存在于腫瘤細胞中，在腫瘤進展中起著重要作用，研究［14-17］表明，宮頸癌病人的疾病進展以及疾病的復發與機體的BAG3 蛋白呈現顯著的相關性，在長期的隨訪分析中，較高BAG3 蛋白表達水平是病人的良好預后的重要指標。

另外，通過對聯合檢測效能的分析，聯合診斷對于宮頸癌的診斷效能顯著高于單獨檢測，提示，通過對腫瘤細胞增殖周期的預測，聯合對腫瘤細胞的形態學的研究，可顯著提升宮頸癌癌前病變的診斷效能。但本研究還存在一定的局限性，由于納入樣本量較低，有待在日后研究中進行大樣本研究。

綜上所述，隨著宮頸癌前病變的進展，P16、BAG3表達增加，BAG3蛋白、P16聯合液基細胞學檢查對于病人的診斷具有積極的意義。