球等鞭金藻MYB基因家族成員全基因組鑒定和特性分析

韓玉瑩　陳璐瑤　陳由強　陳多　陳建楠

摘 要：為了深入理解球等鞭金藻MYB基因家族在基因調控網絡中的作用機制，使用MYB_DNA-binding保守結構域在球等鞭金藻蛋白序列中篩選出60個MYB基因家族成員，并對這些基因家族成員的蛋白（一、二、三級）結構預測和分析、亞細胞結構定位、基因結構及保守結構域等方面進行了分析。結果表明：這些MYB基因家族成員可分為3個cluster，其中R2-MYB和R3-MYB主要集中在cluster 3中，R2R3-MYB則含有大部分家族成員，表明這些基因在球等鞭金藻中起著重要的生物學功能。不同分支的親緣關系較遠，同一分支的關系較近，這表明球等鞭金藻MYB基因家族在演化過程中形成了一些適應性的變化。通過基因組內共線性分析，研究發現球等鞭金藻全基因組內有177對片段復制基因和46對串聯復制基因，其中MYB基因家族有2對復制基因，包括串聯重復基因對IZ004267和IZ007345以及片段重復基因對IZ006462和IZ006102。結合染色體定位分析，IZ006462和IZ006102位于9號染色體，這也支持上述片段重復的判斷。這些重復基因對的Ka/Ks值小于1，表明這些基因在擴張過程中受到了基因純化選擇，功能相當保守。

關鍵詞：球等鞭金藻；MYB基因家族；全基因組；光質；表達分析

中圖分類號：Q 943.2 文獻標志碼：A 文章編號：0253-2301（2023）04-0022-14

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.04.004

Genome-wide Identification and Characteristic Analysis ofMYB Gene Family Members in Isochrysis galbana

HAN Yu-ying1，2，3， CHEN Lu-yao1，3， CHEN You-qiang1，2，3， CHEN Duo1，2，3， CHEN Jian-nan1，2，3*

（1. Public Service Platform for Industrialization Development Technology of Marine Biological Medicine and Products，

Fuzhou， Fujian 350117， China; 2. Fujian Key Laboratory of Special Marine Bioresource Sustainable Utilization， Fuzhou，

Fujian 350117， China; 3. College of Life Science， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350117， China）

Abstract： In order to further understand the mechanism of the MYB gene family in the gene regulatory network， the MYB_DNA-binding conserved domain was used to screen 60 MYB gene family members from the protein sequences of Isochrysis galbana. Then， the protein （primary， secondary and tertiary） structure prediction and analysis， subcellular structure localization， gene structure， and conserved domains of these gene family members were analyzed. The results showed that： these MYB gene family members could be divided into three clusters， among which R2-MYB and R3-MYB were mainly concentrated in cluster 3， and R2R3-MYB contained most of the family members， indicating that these genes played an important biological function in Isochrysis galbana. The distant relationship between different branches and the close relationship within the same branch indicated that the MYB gene family in Isochrysis galbana had undergone some adaptive changes during the evolution process. Through the analysis of collinearity in the genome， the study found that there were 177 pairs of segmental duplication genes and 46 pairs of tandem duplication genes in the whole genome of Isochrysis galbana， among which there were 2 pairs of duplication genes in the MYB gene family， including the tandem duplicated gene pair IZ004267 and IZ007345， and the segmental duplicated gene pair IZ006462 and IZ006102. By combining with the analysis of chromosomal localization， IZ006462 and IZ006102 were located on chromosome 9， which also supported the above judgment of segmental duplication. The Ka/Ks values of these duplicated gene pairs were less than 1， indicating that these genes were subjected to gene purification selection during expansion and their functions were quite conserved.

Key words： Isochrysis galbana；MYB gene family； Whole genome； Light quality； Expression analysis

球等鞭金藻Isochrysis galbana是一種單細胞海藻，大小約5 μm，呈金褐色，通常呈橢圓形或球形，有兩條等長光滑的鞭毛，在水體中能緩慢轉動或旋渦狀運動[1]。球等鞭金藻具有完整的生物代謝通路和細胞器，具有較高的研究價值。作為一種模式生物，球等鞭金藻在光合作用、細胞周期調控、信號轉導、膜轉運、細胞骨架和藥物發現等領域被廣泛研究。球等鞭金藻富含多種不飽和脂肪酸，如巖藻黃素和DHA，是一種珍貴的藻類資源[2-5]。MYB基因家族是一類重要的轉錄因子家族，廣泛參與植物生長發育、代謝物合成、激素信號傳導等生理過程。MYB轉錄因子在植物中數量和功能最多[6-7]。對于該轉錄因子在類胡蘿卜素合成過程中調控作用的研究也比較多。王拓璋等[8]通過對鱷梨全基因組的MYB轉錄因子基因序列分析，得到92個PaMYB基因序列，轉錄組表達分析顯示有68個PaMYB基因在干旱脅迫下表達，72個PaMYB基因在低溫脅迫下表達。為深入研究PaMYB轉錄因子非生物脅迫提供科學理論依據。闕秋霞等[9]從刺葡萄愈傷組織轉錄組數據鑒定并克隆出9個VdMYB家族基因，并利用生物信息學方法分析和預測其結構和功能，同時分析其在不同光質誘導下的表達模式，9個VdMYB啟動子序列中均有大量光響應等多種生物/非生物響應元件。qRT-PCR分析表明，光質顯著影響VdMYBs基因的表達，不同光質作用下，VdMYBs基因響應模式與結構特征相對應；VdMYB31/VdMYBB1和VdMYB4A基因分別作為正負調控因子參與花青素生物合成。本研究為進一步解析MYB基因通過響應光信號參與調控刺葡萄愈傷組織花青素生物合成的分子機制提供理論參考。

本課題組前期在球等鞭金藻研究中，已經發現了一些MYB基因的存在，MYB基因在不同光質培養下的表達模式也存在差異，藍光抑制球等鞭金藻巖藻黃素含量的積累，不利于脂肪酸積累，轉錄組學分析揭示了R2-MYB轉錄因子IZ014151可能是球等鞭金藻光合色素巖藻黃素合成的關鍵調控基因。本研究對球等鞭金藻MYB基因家族進行了全面鑒定，包括基因家族成員鑒定和蛋白質理化特性分析、亞細胞結構定位分析、二級結構和三級結構預測分析、基因家族結構和保守結構域分析、基因家族特征motif分析、染色體定位分析、系統發育進化樹構建、共線性分析及基因復制對中的Ka/Ks分析和基因家族啟動子分析，并揭示了其在不同光質下的表達模式和進化特征，可為后續深入研究球等鞭金藻中MYB基因家族的功能打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

球等鞭金藻Isochrysis galbana藻株為LG007，系本課題組林崗教授分離，保藏于本實驗室。將球等鞭金藻以1×106個·mL-1密度接種于錐形瓶內，均放置于白光培養箱培養。所用培養基為f/2培養基。培養條件：光照強度70 μmol·m-2·s-1，溫度（22±1）℃，光照周期24 h，每天定時搖瓶3次。

1.2 基因家族成員鑒定和蛋白質理化特性分析

從Pfam（http：//pfam.xfam.org）數據庫中下載MYB_DNA-binding的隱馬爾科夫模型的HMM文件，Pfam編號PF00249。在HMMER 3.0軟件通過hummerseach命令（hmmsearch.exe./ MYB_DNA-binding.hmm./ IZ.pep>IZ-MYB.txt）提取出含有MYB保守結構域的蛋白序列ID（E-value為1e-05），利用TBtools軟件和球等鞭金藻蛋白fasta文件提取候選ID的序列。通過Batch CD-Searc（CDD）（Batch CD-Search：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi），將結構域不完整以及重復冗長的序列刪除，剩余的即為基因家族成員。將鑒定的基因家族成員的蛋白序列上傳至ProtParam（ProtParam：https：//web.expasy.org/protparam），分析其等電點、分子量等理化性質，從基因組的gff文件中提取MYB家族成員的全長和CDS長度信息。

1.3 亞細胞結構定位分析

1.3.1 亞細胞結構定位分析 利用Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi）、ProtComp 9.0（http：//linux1.softberry.com/all.htm）和WolfPSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp）在線軟件分別對基因家族成員蛋白進行亞細胞結構定位預測。綜合3種預測結果，評估預測結果。

1.3.2 跨膜結構域預測 利用在線軟件TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）進行跨膜結構域預測。

1.3.3 信號肽預測 利用在線軟件SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1）對基因家族蛋白成員進行信號肽預測，輸出結果mean D顯示“YES”則表示有信號肽，“NO”表示沒有信號肽。

1.4 二級結構和三級結構預測分析

通利用在線軟件GOR IV（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html）預測基因家族成員的二級結構。

利用SWISS-MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org）在線軟件預測蛋白的三級結構。利用GMQE值和QMEAN值進行評估，GMQE值為0～1，QMEAN值為-4～0，其中GMQE值越大表示模型越可靠，QMEAN值越大表示預測蛋白與模板蛋白的匹配度越高。

1.5 基因家族結構和保守結構域分析

首先利用Batch WB CD search tool（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）在線工具將最終確定的基因家族進行功能結構域分析，將分析結果下載后在Excel中打開，只保留Query、From、To、short name這四列，將這四列的信息復制到TBtools軟件中，并將gff3文件也拖入該軟件中，繪制基因結構圖。將基因家族成員的蛋白序列上傳至Pfam數據庫，分析其保守結構域，保存結果，然后利用TBtools的Visualize Domain Pattern程序對Pfam的分析結果進行可視化分析。

1.6 基因家族特征motif分析

通過在線工具MEME（http：//meme-suite.org）分析保守的蛋白結構域，將已確定的蛋白序列上傳到MEME中，將得到的mast.xml文件結果保存，利用蛋白ID和mast.xml文件在TBtools軟件中繪制并優化圖片。

1.7 染色體定位分析

用TBtools在gff3文件中提取出球等鞭金藻的基因所在染色體的位置文件以及染色體的長度文件，在這兩個文件中提取出基因家族的信息和基因所在染色體的長度。之后用MapGene2Chromosome v2（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0）在線工具進行基因染色體定位的繪制和編輯。

1.8 系統發育進化樹構建

從NCBI數據庫中下載萊茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）和三角褐指藻（Phaeodactylumtricornutum）蛋白質序列fasta文件，用ClustalW軟件對Phaeodactylumtricornutum、Chlamydomonasreinhardtii以及球等鞭金藻基因家族成員蛋白序列進行氨基酸序列比對，分別構建球等鞭金藻、萊茵衣藻和三角褐指藻的MYB家族的系統發育進化樹。利用iTOL在線軟件進行進化樹優化。

1.9 共線性分析及基因復制對中的Ka/Ks分析

首先利用MCScanX（http：//chibba.pgml.uga.edu/mcscan2）軟件進行基因組內共線性分析，利用TBtools軟件對共線性分析結果進行可視化。利用gff文件和blast文件（基因組內自身blast文件），運行MCScanX軟件得到collinearity 共線性文件和tandem串聯基因對文件。

TBtools軟件可視化步驟如下：先將collinearity文件轉換成基因對txt文件（用Text Merge for MCScanX功能），然后利用TBtools軟件從gff文件中提取染色體長度和基因位置的信息，整理成txt文件，在Text Transformat for Micro-Synteny View功能中輸入染色體長度和位置的txt文件，得到基因對inks文件。最后在Advanced Circos程序中輸入染色體長度txt文件和基因對inks文件進行可視化分析。

利用TBtools程序中的Simple Ka/Ks Calculator9（NG）計算重復基因對的Ka/Ks（非同義替換率與同義替換率的比值）。當Ka/Ks>> 1，基因受正向選擇（Positive selection）；當Ka/Ks=1，基因中性進化（Neutral evolution）；當Ka/Ks<< 1，基因受純化選擇（Purify selection）。

1.10 基因家族啟動子分析

利用TBtools程序中的Gtf/Gff3 Sequences Extractor，提取球等鞭金藻CDS上游2000 bp的fasta文件，然后再利用啟動子序列在Quick Fasta Extractor or Filter 中提取目標基因的啟動子序列，檢查文件信息是否正確（Fasta Stater），最后將其序列全部轉化成大寫，提交到PlantCARE（http： //bioinformatics. psb. ugent.be/webtools/plantcare/html）網站進行順勢作用元件預測。將得到的結果進行整理和簡化，上傳至TBtools進行啟動子可視化分析。

2 結果與分析

2.1 MYB基因家族成員鑒定及蛋白特性分析

由表1可知，這60個MYB基因序列長度差異較大，長度在752～4561 bp；蛋白質相對分子質量在17517.93～116173.07 Da；氨基酸數目差異較大，最少的有155個氨基酸，最多的有1463個；等電點在4.34～10.18，其中只有少數為堿性蛋白；不穩定系數在22.02～77.91（>40時認為是不穩定蛋白），脂肪系數在52.48～84.96，平均親水性均小于0，所以該家族成員多為不穩定親水性蛋白。以上結果表明，同一家族成員的理化特性可能存在較大的差異，因此，它們的結構功能也會有所不同。

2.2 MYB基因家族亞細胞結構定位

利用3種在線軟件對球等鞭金藻MYB蛋白進行亞細胞定位預測分析。Cell-PLoc的預測結果顯示，有59個MYB蛋白定位于細胞核，只有1個蛋白（IZ003768）定位于細胞膜。ProtComp9.0的預測結果顯示44個MYB蛋白定位于細胞核。WolfPSORT的預測結果顯示有56個MYB蛋白定位于細胞核，其中IZ001203蛋白定位于液泡，IZ007734和IZ008056蛋白定位于線粒體，IZ010753蛋白定位于葉綠體。在WolfPSORT和ProtComp 9.0軟件均預測IZ008056蛋白定位于線粒體。對于IZ001203、IZ007734、IZ010753、IZ008056蛋白，3個軟件預測結果不一致，還有待進一步確定。由表2可知，3個軟件預測均定位于細胞核的蛋白有34個（IZ000218、IZ001231、IZ001488、IZ001787、IZ001968、IZ003225、IZ003491、IZ003666、IZ003672、IZ004101、IZ004267、IZ004469、IZ004656、IZ004905、IZ005555、IZ005588、IZ006315、IZ007092、IZ007542、IZ007617、IZ010306、IZ010353、IZ010554、IZ010827、IZ011696、IZ011780、IZ011921、IZ012323、IZ012697、IZ012811、IZ013719、IZ014349、IZ014568、IZ014686），故推測這些蛋白有著相似的結構和表型理化特征。

對目的蛋白進行跨膜結構域預測，結果表明除了IZ001203、IZ003517蛋白（圖1）外，其他均無跨膜結構域，說明他們都不屬于跨膜類蛋白，因此也不會產生跨膜運動。而IZ001203蛋白在前端約25個氨基酸殘基的位置，IZ003517蛋白在末端約25個氨基酸殘基的位置有跨膜結構域，故推測IZ001203和IZ003517蛋白具跨膜功能。對目的蛋白進行信號肽預測，結果表明60個蛋白中只有IZ001203蛋白（圖2）有信號肽。結合蛋白跨膜結構域預測結果，IZ001203蛋白具有跨膜功能，與信號肽預測結果相符。綜上，IZ001203屬穩定親水性蛋白，有信號肽而且可以進行跨膜運動。

2.3 MYB基因家族二級結構、三級結構分析

由表3可知，對獲得的60個MYB基因編碼的蛋白進行二級結構預測，這60個蛋白均含有α-螺旋，所占比例在18.61%～58.41%；無規則卷曲是最主要的結構形式，所占比例高達35.2%～68.61%；延伸鏈結構所占比例最少，在2.27%～22.93%。

由圖3可知，對球等鞭金藻MYB轉錄因子進行三級結構分析預測，可知每個MYB_DNA-binding結構域都有3個α-螺旋，這3個螺旋之間互相形成一定的角度，且第2個與第3螺旋之間形成1個β-轉角，與二級結構預測結果基本相符。

2.4 MYB基因家族結構和保守結構域分析

根據MYB_DNA-binding結構域在每個MYB蛋白上重復出現次數，將60個MYB家族成員按照R1-MYB、R2-MYB（R2R3-MYB）、R3-MYB、R4-MYB這4種類型進行歸類，詳細信息見表4。結果表明球等鞭金藻R1-MYB有19個，R2-MYB有22個，R3-MYB有6個，R4-MYB有3個。

由圖4可知，60個球等鞭金藻MYB基因家族成員的結構存在較大差異，其中有21個基因無內含子，其他基因內含子數目為1～10個，編碼區數量為1～10個。綜合來看，MYB基因家族成員中IZ004101基因長度最長，為4561 bp，且內含子和編碼區數量最多。保守結構域大多數分布在基因的5′端，且保守結構域的長度相似。

此外，還發現有10個MYB成員有MYB_DNA-bind_6結構域（IZ00218、IZ012697、IZ012811、IZ001231、IZ003225、IZ004469、IZ007941、IZ011921、IZ003491、IZ004905）。MYB_DNA-binding和MYB_DNA-bind_6家族均包含來自MYB蛋白的DNA結合結構域，所以推測MYB_DNA-binding、MYB_DNA-bind_6的保守結構域相似。

2.5 MYB基因家族特征motif分析

由圖5可知，MYB基因家族motif分析，該基因家族共有10個motif，motif 4、6、2多位于MYB蛋白的5′端，motif 1位于MYB功能結構域中間位置，motif 7位于MYB功能結構域3′端。Motif數量最少的僅有1個，最多有12個。大部分球等鞭金藻MYB蛋白均不含motif 9和motif 8，只有IZ001231、IZ011246、IZ003491含有motif 9，IZ004267、IZ007345含有motif 8。

2.6 MYB基因家族染色體定位

由圖6可知，球等鞭金藻MYB基因家族各成員分布在9條染色體上，每條染色體上基因數目存在差異，數量在3～12個，其中8號染色體上數量最多，共有12個基因，且各基因在染色體上的距離較近，其中IZ003517和IZ003491基因在染色體上的位置相近。其次是1號染色體，包含9個基因，其中IZ001203和IZ001231這兩個基因位置相近。12號和9號染色體上，IZ010306和IZ010353、IZ005588和IZ005555基因位置也相鄰。從11號、12號、8號染色體中可以看到，在染色體上的某個區域家族成員比較集中。IZ004469和IZ004470基因長度分別為1404 bp、1469 bp，且均定位于細胞核。結合染色體定位分析發現IZ004469和IZ004470這兩個基因位置緊密相連，形成明顯的基因簇。

2.7 MYB基因家族系統發育進化樹

由圖7可知，球等鞭金藻、萊茵衣藻和三角褐指藻的MYB基因家族系統發育進化樹劃分為3個cluster，cluster 1包含17個成員，8個為球等鞭金藻的MYB家族成員；cluster 2僅包含5個球等鞭金藻的MYB家族成員；cluster 3包含成員最多，83個成員中包含47球等鞭金藻的MYB家族成員。根據進化樹分析可知，4R-MYB主要在cluster 2中，包括IZ001032和IZ001488。此外，第9 d白光組與藍光組的差異表達基因IZ014151、IZ006462（R2-MYB轉錄因子）也被劃分到cluster 2中。R1-MYB 在cluster1中有分布，但主要和R2-MYB、R3-MYB集中在cluster 3中。

2.8 基因組內共線性分析及基因復制對分析

由圖8可知，為球等鞭金藻基因組內共線性分析，發掘MYB家族的基因復制事件。黃色的一圈每個模塊表示球等鞭金藻基因組的染色體，紅色的一圈代表染色體相對應的基因密度。共線性基因（片段復制基因）用線條連接，灰色連線為球等鞭金藻基因中全部片段復制基因對的連線，最外圈標注為MYB基因家族的片段復制基因ID，其共線性關系用紅色連線展示。通過共線性分析發現，球等鞭金藻全基因組內有177對片段復制基因和46對串聯復制基因。其中MYB有2對復制基因，表明MYB基因家族的擴張主要來自串聯復制和片段復制。

由表5可知，顯示這些重復基因Ka/Ks＜1，表明MYB基因家族擴張過程中，基因復制對受到基因純化選擇，所以它們的功能也相當保守。

3 結論與討論

MYB_DNA-binding保守結構域是一種廣泛存在于不同生物界中的轉錄因子保守結構域，通常由3個串聯的結構域組成：R1-MYB、R2-MYB和R3-MYB。這3個結構域中的R2-MYB結構域通常是DNA結合的主要部位，包含了一個雙頂花環結構，該結構通過與DNA中的核苷酸相互作用，實現MYB蛋白與DNA序列的結合[10]。MYB_DNA-binding保守結構域在植物、動物和真菌中均有發現，它對于調控生長發育、代謝物合成以及激素信號傳導等生理過程具有重要作用[11]。本研究利用Myb_DNA-binding保守結構域在球等鞭金藻蛋白序列、利用Pfam數據庫以及hummer程序中篩選鑒定到60個MYB基因家族成員。對這些基因家族成員蛋白一、二、三級結構預測及分析、亞細胞結構定位、基因結構及保守結構域等方面進行分析。經分析球等鞭金藻MYB家族基因序列長度差異較大，在752～4561 bp，蛋白質相對分子質量在17517.93～116173.07 Da，氨基酸數目差異較大，155～1463個，多為不穩定親水性蛋白，其中只有IZ001203和IZ003517蛋白為跨膜類蛋白；分布在9條染色體上，IZ004469和IZ004470這兩個基因在8號染色體上緊密相連，形成明顯的基因簇。

球等鞭金藻MYB基因家族可以劃分為3個cluster，其中R2-MYB和R3-MYB主要集中在cluster 3中，不同分支的親緣關系較遠，同一分支的關系較近，可以推測，球等鞭金藻MYB基因家族在不斷的演化過程中形成一些適應性的變化。

基因共線性是指在具有同源性關系的2個物種中，其基因組中有共同的連鎖基因，且同源基因的相對順序具有較高保守性的現象[12]。在生物進化中，基因組會在全基因組復制、染色體重組、染色體倒位和易位等過程中發生結構和數量的變化[13-14]。因此，基因組的共線性分析在非編碼序列的確認、新測序物種的注釋和全基因組復制事件的估計等過程中具有重要作用[15-16]。

通過基因組內共線性分析，發現球等鞭金藻全基因組內有177對片段復制基因和46對串聯復制基因。其中MYB基因家族有2對復制基因，串聯重復基因對：IZ004267與IZ007345；片段重復基因對：IZ006462與IZ006102。結合染色體定位分析，IZ006462與IZ006102位于同一條染色體（9號染色體），且在染色體上的位置相近，這也支持上述片段重復的判斷。這些重復基因對Ka/Ks＜1，表明MYB基因家族擴張過程中，這些重復基因對都受到基因純化選擇，所以它們的功能也相當保守。

球等鞭金藻MYB基因家族成員均含有多個光響應元件，且光響應元件是基因家族成員所有啟動子順式作用元件中最多的作用元件，可能與光的接收、生物鐘的調控有關。光會影響植物在整個生命周期的發展過程，在植物中凡是能感受到不同光現象的物質均被稱為光受體。光周期途徑是光受體對不同的光信號感知后做出一系列的響應活動，進而達到調控植物開花，影響根、莖的形成以及調節葉落和芽休眠時間的作用[17-19]。此外，特定基因組的轉錄調控是光調節植物生長發育的關鍵機制之一。也有許多與植物生長激素相關的響應元件，如脫落酸響應元件、生長素響應元件、茉莉酸響應元件及水楊酸響應元件等，說明這3個家族與植物生長發育密切相關；還有其他非生物脅迫響應元件，說明它們可能參與逆境脅迫響應等其他功能。

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（責任編輯：柯文輝）

收稿日期：2023-03-17

作者簡介：韓玉瑩，女，1994年生，碩士，主要從事分子生物學研究。

*通信作者：陳建楠，男，1991年生，實驗師，主要從事球等鞭金藻培育研究（E-mail：381220681@qq.com）。

基金項目：國家現代農業產業技術體系項目 （CARA-170501）。