銀翹解毒片中摻偽山銀花成分監測*

劉益慶，吳琦，趙猛，陳洪巖，錢明明，李玲

連云港市食品藥品檢驗檢測中心，連云港222006

銀翹解毒片收載于《中國藥典》2020 年版一部，由金銀花、連翹、薄荷、荊芥、淡豆豉、牛蒡子（炒）、桔梗、淡竹葉、甘草九味藥組成，具有疏風解表、清熱解毒的功效[1]。《中國藥典》2005 年版開始將金銀花和山銀花分列為兩個標準，金銀花為單一來源，即忍冬科植物忍冬（Lonicera japonicaThunb.）；山銀花有4種植物來源，分別為忍冬科植物灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoidesHand.-Mazz.）、紅腺忍冬（Lonicera hypoglaucaMiq.）、華南忍冬（Lonicera confusaDC.）或黃褐毛忍冬（Lonicera fulvoto-mentosaHsu et S.C.Cheng）。金銀花和山銀花外觀性狀差異較大，但投料制成中成藥后卻難以辨別，由于山銀花較金銀花產量大、價格低，因此市場上金銀花中摻雜山銀花現象屢見不鮮。金銀花與山銀花為近緣植物，兩者都含有綠原酸，但作為藥用成分的木犀草苷，金銀花中含量較高，而山銀花中含量很少。此外，由于山銀花含有大量的皂苷類成分，臨床上存在溶血致敏的風險。通過查閱文獻，金銀花中摻偽山銀花的檢驗方法有顯微特征鑒別[2]、薄層色譜法[3]、DNA 條形碼技術[4]、近紅外光譜技術[5]、高效液相色譜法[6，7]、高效液相色譜-質譜聯用方法[8，9]等，本文擬通過優化分析方法，建立科學準確高效普及的檢驗方法用于檢測銀翹解毒片中摻偽山銀花的成分。

1 儀器與試藥

Vanquish 型高效液相色譜儀（電噴霧檢測器，美國賽默飛公司）；BP211D 型電子天平（德國賽多利斯公司）；1290-6470 Triple Quad 超高效液相色譜-質譜聯用儀（美國安捷倫科技有限公司）；UV240型紫外分光光度計（日本島津公司）。

灰氈毛忍冬皂苷乙對照品（批號111814-202106，含量96.1%），川斷續皂苷乙（批號111813-201804，含量96.8%），山銀花對照藥材（批號121595-201202），金銀花對照藥材（批號121060-201608）均購自中國食品藥品檢定研究院；銀翹解毒片42 批（A 企業200201、200301、200401、210202、210801等，B 企業19910001、19910002、199910003，C 企業 1201001、1201002、1201003等，D 企業20210469、20210868等，E 企業21122922，F 企業410270、410320等，G 企業202101、202102、202103等，H 企業18005，I 企業200102等，J 企業190703、200602 等）；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純（德國Merk 公司）；純凈水由Milli-Q 純水儀制備。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

對照品溶液：取灰氈毛忍冬皂苷乙對照品約12 mg、川續斷皂苷乙對照品約10 mg，精密稱定，置于100 mL 量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。

山銀花對照藥材溶液：取山銀花對照藥材約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，50%甲醇補足失重，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

金銀花對照藥材溶液：取金銀花對照藥材約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，50%甲醇補足失重，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

供試品溶液：取本品10片，研細，取約0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，50%甲醇補足失重，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

摻入3%山銀花、摻雜5%山銀花溶液：根據銀翹解毒片處方和制法，分別按3%、5%比例摻入山銀花投料，制成摻入不同投料比例山銀花的模擬樣品，按照“供試品溶液”制備。

2.2 色譜條件

色譜柱為Superiorex ODS C18（250mm×4.6 mm，5 μm），流速為1.0 mL·min-1，以乙腈為流動相A，水為流動相B，行梯度洗脫：0～10.0 min，20%→30%A；10.0～25.0 min，30% A；25.0～36.0 min，30%→20%A，柱溫30℃，進樣量10 μL。電噴霧檢測器條件：霧化器溫度45℃，采集頻率10 Hz，濾光片10.0 s；理論板數按灰氈毛忍冬皂苷乙峰計算應不低于5000。

2.3 專屬性考察

分別取“2.1”項下的對照品溶液、山銀花對照藥材、金銀花對照藥材、供試品溶液按“2.2”項下色譜條件進行檢測。結果（圖1）表明，在與灰氈毛忍冬皂苷乙對照品和川續斷皂苷乙對照品色譜保留時間相同的位置上，山銀花對照藥材檢出相應色譜峰，而金銀花對照藥材未檢出相應色譜峰，表明采用灰氈毛忍冬皂苷乙和川續斷皂苷乙作為區分山銀花與金銀花的特征成分是可行的。摻偽山銀花的銀翹解毒片色譜圖中檢出灰氈毛忍冬皂苷乙成分，而正常的銀翹解毒片色譜圖中未檢出灰氈毛忍冬皂苷乙和川續斷皂苷乙成分。

圖1 山銀花對照藥材（A）、金銀花對照藥材（B）、混合對照品（C）、摻偽樣品（D）及正常樣品（E）HPLC-CAD 色譜圖

2.4 線性關系考察

分別精密吸取對照品溶液2、5、10、15、20、30、60 μL，依次進樣分析，記錄峰面積，以進樣量（μg）的常用對數為橫坐標，以峰面積的常用對數為縱坐標進行線性回歸，灰氈毛忍冬皂苷乙的回歸方程為：Y1=1.598 5X1+4.587 2，r=0.999 2；川續斷皂苷乙的回歸方程為：Y2=2.260 8X2+1.806 9，r=0.999 3；結果表明：灰氈毛忍冬皂苷乙在0.239～7.158 μg、川續斷皂苷乙在0.202～6.066 μg 范圍內線性關系良好。

2.5 精密度試驗

取線性關系中間濃度的對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件重復進樣6次，結果灰氈毛忍冬皂苷乙和川續斷皂苷乙峰面積的RSD 分別為0.86%和1.02%（n=6）。

2.6 重復性試驗

取摻偽樣品（廠家A，批號200201），按“2.1”項下方法平行制備6份，按“2.2”項下色譜條件測定灰氈毛忍冬皂苷乙和川續斷皂苷乙含量，結果其濃度的RSD 分別為0.98%和1.15%（n=6）。

2.7 穩定性試驗

取“2.6”項下供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h 進樣，結果灰氈毛忍冬皂苷乙和川斷續皂苷乙峰面積的RSD 為1.27%和1.33%（n=6）。

2.8 耐用性試驗

取“2.6”項下供試品溶液，分別選擇3 根長度和粒徑均為250 mm 和5 μm 不同廠家色譜柱（Superiorex ODS C18、Phenomenex Luna C18、Welch Ultimate XB-C18），按照“2.2”項下色譜條件檢測，結果灰氈毛忍冬皂苷乙保留時間和峰面積的RSD 分別為0.41%和1.03%，川續斷皂苷乙保留時間和峰面積的RSD 分別為0.56%和1.48%。

2.9 加樣回收率試驗

稱取已知含量的摻偽樣品（廠家A，批號200201）約0.6 g 9份，分別加入灰氈毛忍冬皂苷乙對照品和川續斷皂苷乙對照品適量，按“2.1”項下方法制備，按“2.2”項下色譜條件測定，計算回收率，結果見表1～2。

表1 灰氈毛忍冬皂苷乙回收率試驗

表2 川續斷皂苷乙回收率試驗

3 樣品含量測定

取3 批摻偽樣品（廠家A，批號200201、210202、210801），按“2.1”項下的方法制備供試品溶液，按照“2.2”項下的色譜條件進行測定：結果測得灰氈毛忍冬皂苷乙含量分別為8.412、6.978、7.491 mg·g-1；川續斷皂苷乙含量分別為0.742 7、0.701 6、0.712 2 mg·g-1。

4 質譜確認

對檢出的11 批摻偽樣品做質譜確認，通過ESI+掃描，灰氈毛忍冬皂苷乙一級質譜m/z 為1 397.66，以m/z 1 397.66 為母離子的二級質譜有1 073.55、911.48，見圖2A～D；川續斷皂苷乙一級質譜m/z 為1 057.66，以m/z 1 057.666 為母離子的二級質譜有619.41、455.35，見圖2E～H。

圖2 灰氈毛忍冬皂苷乙對照品一級（A）、二級（B），樣品一級（C）、二級（D）質譜圖；川續斷皂苷乙對照品一級（E）、二級（F），樣品一級（G）、二級（H）質譜圖

5 討論

流動相曾摸索過0.1%甲酸-乙腈、0.1%三氟乙酸-乙腈、水-乙腈，三者專屬性一樣，從環境考慮，選擇水-乙腈系統。供試品提取方法曾摸索過甲醇、乙腈、50%甲醇、乙醇等，采用超聲和加熱回流兩種方式，時間選擇10、30 和60 min，最終確定50%甲醇超聲30 min 最為合適。摻入3%山銀花和摻入5%山銀花作為正常樣品和摻偽樣品的判定依據，《中華人民共和國藥典》2020 年版四部通則0212 藥材和飲片檢定通則中規定：藥屑及雜質不得過3%，基于中成藥的處方和工藝，本文分別考察摻入3%山銀花和5%山銀花供試品中灰氈毛忍冬皂苷乙的檢測限，結果摻入3%山銀花供試品未檢出，摻入5%山銀花供試品檢出，在42 批樣品中檢出11 批摻偽成分。同時，與HPLC-ELSD 法相比，HPLC-CAD 法檢測的響應值和靈敏度更優。

選擇四級桿飛行質譜串聯，在定性鑒別上分辨率高，專屬性強，一級質譜和二級質譜的質荷比（m/z）可精確到小數點后4 位。