磁珠法提取新型冠狀病毒核酸的穩(wěn)定性

秦冬梅，楊志（通信作者），肖光軍，周波，曾玉蘭

1 大英縣人民醫(yī)院 （四川大英 629300）；2 遂寧市中心醫(yī)院 （四川遂寧 629000）

新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）核酸檢測結(jié)果在新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）的診療過程中具有極其重要的作用，既是確診證據(jù)，又是解除隔離管理標(biāo)準(zhǔn)和出院標(biāo)準(zhǔn)[1]。實時熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）法具有操作方便、快速、高效、高特異性、高靈敏度等優(yōu)點[2-3]，因此成為我國絕大多數(shù)實驗室檢測SARS-CoV-2 核酸的首選方法[4]。而核酸提取是實時熒光RT-PCR法必不可少的前處理步驟，其中磁珠法因具有快捷、高效、重復(fù)性好、高通量、自動化等優(yōu)點[5-6]而被廣泛采用。

磁珠法提取核酸所需時間明顯短于實時熒光RTPCR 法檢測核酸所需時間，因此在SARS-CoV-2 核酸檢測工作中時常出現(xiàn)核酸提取后無法立即進(jìn)行擴(kuò)增分析的情況，且樣本量越大越容易出現(xiàn)該情況。《醫(yī)療機(jī)構(gòu)新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊（試行第二版）》[7]明確規(guī)定了無法及時檢測樣本的保存方式，但并未明確無法及時檢測的核酸保存方式。本研究初步探索了磁珠法提取SARS-CoV-2 核酸及其與試劑混合后在4 ℃和20 ℃條件下的穩(wěn)定性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

以國家衛(wèi)生健康委員會臨床檢驗中心（National Center for Clinical Laboratories，NCCL）和 四 川 省臨床檢驗中心（Sichuan Province Center for Clinical Laboratories，SPCCL）提供的室間質(zhì)量評價（external quality assessment，EQA）樣本作為試驗樣本，詳情如下：NCCL 樣本共12 份，為SARS-CoV-2 核酸檢測（接收集中隔離點樣本檢測機(jī)構(gòu)）EQA 活動2022 年第2、3、4、5 次EQA 樣本，批號分別為22FEB01、22FEB02、22FEB03、22MAR01、22MAR02、22MAR03、22APR01、22APR02、22APR03、22MAY01、22MAY02、22MAY03，依次編號為A1～A12；SPCCL 樣本共20 份，為SARSCoV-2 核酸檢測B 室間質(zhì)評活動2022 年第2、3、4、5 次EQA 樣本，批號分別為B220211～B220215、B220311～B220315、B220411～B220415、B220511～B220515，編號依次為B1～B20。將以上樣本分為4 組：第1 組包含A1～A3 和B1～B5；第2 組包 含A4～A6 和B6～B10；第3 組 包 含A7～A9 和B11～B15；第4 組包含A10～A12 和B16～B20。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

西安天隆科技有限公司提供的全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)（型號：Gentier96E）和全自動核酸提取儀（型號：GeneRotex96）；江蘇新康醫(yī)療器械有限公司提供的快速混勻器（型號：XK80-A）；大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）股份公司提供的掌上離心機(jī)（型號：D1008E）；青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司提供的生物安全柜（型號：HR40-11A2）和醫(yī)用冷藏冷凍冰箱（型號：HYCD-282A）。

1.2.2 試劑及耗材

西安天隆科技有限公司提供的磁珠法核酸提取或純化試劑（qEx-DNA/RNA 病毒，規(guī)格：64T/盒）；圣湘生物科技股份有限公司提供的熒光PCR 法核酸檢測試劑盒（48 人份）；帝恩生物科技（香港）有限公司提供的8 聯(lián)PCR 管（0.2 ml，光學(xué)平蓋）；江蘇大唐醫(yī)療器械有限公司提供的離心管（1.5 ml）。

1.3 方法

1.3.1 樣本處理

NCCL 樣本為凍干粉，試驗前先瞬離，再加入附帶的去離子水500 μl，上下顛倒5 次，靜置15 min，復(fù)溶后用快速混勻器混勻15 s，再用掌上離心機(jī)離心15 s。

SPCCL 樣本先于室溫下平衡20 min，待解凍后用快速混勻器混勻15 s，再用掌上離心機(jī)離心15 s。

1.3.2 核酸提取

取處理后的樣本200 μl 至核酸提取或純化試劑預(yù)裝板的第1 列或第7 列，再在第2 列和第8 列放入攪拌套，最后放入全自動核酸提取儀并啟動核酸提取程序。每份樣本均雙孔提取，提取完畢的核酸立即轉(zhuǎn)移至離心管。兩孔來自同一樣本的核酸轉(zhuǎn)移至同一離心管，混勻后瞬離備用。

1.3.3 擴(kuò)增分析

在試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)按說明書配制核酸檢測試劑，并分裝至八聯(lián)管備用。每孔分裝30 μl 試劑。在樣本制備區(qū)的生物安全柜內(nèi)，取20 μl 待測核酸加入上述已分裝試劑的八聯(lián)管內(nèi)，蓋嚴(yán)管蓋，用掌上離心機(jī)離心15 s，轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)用全自動醫(yī)用PCR 分析系統(tǒng)檢測。PCR 程序設(shè)置如下：逆轉(zhuǎn)錄，50 ℃、30 min；預(yù)變性，95 ℃、1 min；擴(kuò)增，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s（采集熒光），循環(huán)45 次，選擇FAM、ROX、HEX 3 個熒光通道。

1.3.4 穩(wěn)定性試驗（靶基因為ORF1ab 基因和N 基因）

SARS-CoV-2 核酸的穩(wěn)定性。第1 組樣本的核酸各檢測5 次：提取后立即檢測1 次，記錄循環(huán)閾值（即Ct 值）作為初始結(jié)果；余下的核酸于4 ℃保存，分別于第6、12、18、24 天各檢測1 次，記錄Ct 值作為各次結(jié)果；將各次結(jié)果與初始結(jié)果進(jìn)行比較。第2 組樣本的核酸作相似處理，但核酸保存溫度改為20 ℃。無Ct 值時記錄為“-”。

SARS-CoV-2 核酸與試劑混合后的穩(wěn)定性。第3 組樣本的核酸提取后立即加入裝有擴(kuò)增試劑的八聯(lián)管，即與試劑混合成RT-PCR 反應(yīng)體系。每份核酸各加4 孔，其中1 孔立即檢測，記錄Ct 值作為初始結(jié)果；余下3 孔于4 ℃保存，并在第4、8、16 小時各取1 孔進(jìn)行檢測，記錄Ct 值作為各次結(jié)果。將各次結(jié)果與初始結(jié)果進(jìn)行比較。第4 組樣本的核酸作相似處理，但RT-PCR 反應(yīng)體系的保存溫度改為20 ℃。無Ct 值時記錄為“-”。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。比較前剔除無Ct 值的樣本，再對剩余樣本的檢測結(jié)果進(jìn)行配對t檢驗（雙側(cè)檢驗）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SARS-CoV-2 核酸保存不同時間的檢測結(jié)果比較

SARS-CoV-2 核酸于4 ℃或20 ℃保存24 d 內(nèi)各次檢測結(jié)果與初始結(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1 和表2。

表1 SARS-CoV-2 核酸于4 ℃保存不同時間的檢測結(jié)果（ORF1ab 基因/N 基因）

表2 SARS-CoV-2 核酸于20 ℃保存不同時間的檢測結(jié)果（ORF1ab 基因/N 基因）

2.2 SARS-CoV-2 核酸與試劑混合后保存不同時間的檢測結(jié)果比較

SARS-CoV-2 核酸與擴(kuò)增試劑混合后，在4 ℃或20 ℃保存16 h 內(nèi)各次檢測結(jié)果與初始結(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3 和表4。

表3 SARS-CoV-2 核酸與試劑混合后于4 ℃保存不同時間的檢測結(jié)果（ORF1ab 基因/N 基因）

表4 SARS-CoV-2 核酸與試劑混合后于20 ℃保存不同時間的檢測結(jié)果（ORF1ab 基因/N 基因）

3 討論

SARS-CoV-2 核酸檢測工作為防控疫情做出了突出貢獻(xiàn)，是盡快找出傳播源、阻斷傳播鏈的重要手段。在追求高效率的同時，高質(zhì)量的檢測結(jié)果更為重要，假陰性和假陽性結(jié)果均會嚴(yán)重影響疫情防控工作進(jìn)度。《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第九版）》[1]規(guī)定：連續(xù)2 次SARS-CoV-2 核酸檢測ORF1ab 基因/N 基因Ct 值均≥35（熒光定量PCR 方法，界限值為40，采樣時間至少間隔24 h）是解除隔離管理標(biāo)準(zhǔn)和出院標(biāo)準(zhǔn)。綜合以上兩點可知：SARS-CoV-2 核酸檢測工作除了必須保證定性結(jié)果的準(zhǔn)確性，還務(wù)必要重視Ct 值的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。根據(jù)實時熒光PCR 原理可知，Ct 值與樣本核酸濃度的對數(shù)呈負(fù)相關(guān)，因此研究核酸的穩(wěn)定性對于保證Ct 值的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性具有重要意義。

核酸是脫氧核糖核酸（deoxyribo nucleic acid，DNA）和核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）的統(tǒng)稱。SARS-CoV-2 基因組為單股正鏈RNA，全長約29.9 kb。由于環(huán)境中廣泛存在RNA 酶（RNase），且RNA 為單鏈結(jié)構(gòu)，故一般認(rèn)為其穩(wěn)定性不及DNA，容易降解。本研究結(jié)果顯示，磁珠法提取的SARS-CoV-2 RNA 表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性：在4 ℃和20 ℃條件下均能穩(wěn)定至少24 d。SARS-CoV-2 RNA穩(wěn)定性良好的原因如下：（1）核酸提取試劑同時具有提取和純化功能，在工作過程中降解并去除了包括RNase 在內(nèi)的所有蛋白質(zhì)，防止了RNase 對RNA 的降解作用；（2）核酸提取試劑最后的洗脫液成分對RNA 具有穩(wěn)定作用。相關(guān)研究顯示，其他常見RNA 病毒核酸提取后也表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。熊玉娟和周華友[8]發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）RNA 在25 ℃和4 ℃條件下可以穩(wěn)定至少3 d。王婧等[9]也曾報道純化的HCV RNA 及人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）RNA 在2～8 ℃條件下至少可以保存7 d。而JOSé 等[10]的研究顯示，HCV RNA 和HIV RNA在-20 ℃條件下可以穩(wěn)定5 年以上。但王嫣等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，HCV RNA 在25、4、-20 ℃條件下保存70 d，其濃度總體呈下降趨勢，且前12 d 濃度對數(shù)值大約降低1，超出分子診斷領(lǐng)域的允許總誤差（total allowable error，TEA）[12]。王嫣等[11]的研究與本研究結(jié)果存在差異的原因之一可能是核酸提取方法不同：前者使用的Qiagen RNA 病毒提取試劑盒采用硅膠膜吸附柱法，而本研究所用試劑盒采用磁珠法，兩種試劑的組分對RNA 的保護(hù)作用可能存在差別。

本研究結(jié)果顯示，磁珠法提取的SARS-CoV-2 核酸與PCR 試劑混合組成的RT-PCR 反應(yīng)體系也表現(xiàn)出不錯的穩(wěn)定性：在4 ℃和20 ℃均可以至少保存16 h。其原因可能為：（1）PCR 反應(yīng)體系中的緩沖液（buffer）既可穩(wěn)定核酸也可保護(hù)RT-PCR反應(yīng)所需酶（逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA 聚合酶）的活性，即保證了各成分穩(wěn)定而不變質(zhì)；（2）逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA 聚合酶均具有高溫依賴性，4 ℃和20 ℃與兩者的啟動溫度差距較大，即SARS-CoV-2 核酸與試劑混合后在此種溫度始終維持不反應(yīng)的狀態(tài)。

綜上所述，磁珠法提取SARS-CoV-2 核酸在4 ℃或20 ℃可以保存至少24 d，即使與試劑混合后，也可保存至少16 h，檢測結(jié)果不受影響（Ct 值可重復(fù)性良好）。因此，在處理大批量樣本時，如遇提取的核酸無法立即進(jìn)行擴(kuò)增分析，可以在相應(yīng)條件下保存一定時間而不會影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。以最快速度完成核酸提取工作對樣本制備區(qū)的工作人員有一定益處，畢竟長時間穿著防護(hù)服和生物安全柜的噪聲等因素對其身心有一定損害。

本研究的局限性在于：（1）所用樣本并不含真正的SARS-CoV-2，而是來自基因工程制備的假病毒，與臨床樣本或許存在差異；（2）受限于樣本來源，本研究所用樣本量少，濃度覆蓋范圍窄，結(jié)論是否適用于所有濃度水平的樣本還有待進(jìn)一步驗證；（3）受樣本體積和核酸提取試劑洗脫液體積的共同限制，無法得到足夠量的核酸，本研究未探索出磁珠法提取SARS-CoV-2 核酸及其與試劑混合后保持穩(wěn)定的上限時間，也未能評估該結(jié)論是否適用于其他品牌試劑。