鎳鈦合金材料體內(nèi)植入對小鼠免疫功能的影響

戴政寧，王蕊，管博，李華，毛永建，賀學(xué)英（通信作者）

北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院·北京市醫(yī)用生物防護(hù)裝備檢驗(yàn)研究中心 （北京 101111）

鎳鈦合金是鎳和鈦的近等原子合金，具有良好的生物相容性、超彈性和形狀記憶效應(yīng)等特性，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療器械領(lǐng)域，特別是被用于制備口腔、心血管和骨科植入器械[1]。隨著鎳鈦合金植入器械臨床使用率的不斷增加，相關(guān)并發(fā)癥的報(bào)道也越來越多，鎳鈦合金材料的免疫原性也引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。但相關(guān)研究并未在某一鎳鈦合金植入器械的臨床使用失敗與其引起的免疫反應(yīng)之間建立明確的聯(lián)系。

目前，大量科學(xué)證據(jù)揭示了鎳離子對免疫系統(tǒng)的有害影響（包括抑制免疫器官發(fā)育、造成淋巴細(xì)胞凋亡等）[2]；但關(guān)于鎳鈦合金材料體內(nèi)植入對免疫功能影響的研究較少。基于此，本研究通過將鎳鈦合金材料植入小鼠皮下，觀察其對小鼠免疫功能的影響（包括免疫器官、免疫細(xì)胞、抗體和細(xì)胞因子的變化），為評(píng)價(jià)鎳鈦合金材料的免疫毒性提供依據(jù)。

1 儀器、材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與儀器、試劑、材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供的SPF 級(jí)BALB/c 小鼠20 只，均為雌性、6 周齡，合格證號(hào)為SCXK（京）2016-0001。本研究倫理審查編號(hào)為BIMT2020-202。

主要儀器、試劑和材料：購于美國BD 公司的BD CANTO PLUS 流 式 細(xì) 胞 儀、HorizonTMV450 Rat Anti-Mouse CD45、FITC Hamster Anti-Mouse CD3e、PerCP-CyTM5.5 Rat Anti-Mouse CD19、APC Rat Anti-Mouse CD4、PE-CyTM7 Rat Anti-Mouse CD8a、PE Rat Anti-Mouse CD49b、紅細(xì)胞裂解液和Th1/Th2/Th17 CBA Kit；購于武漢普諾賽生命科技有限公司的PBS溶液；購于美國賽默飛公司的Thermo MK3 酶標(biāo)儀，購于美國Bethyl 公司的小鼠IgM 和IgG 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒；購于國內(nèi)某金屬材料有限公司的鎳鈦合金材料（Ni/Ti:55/45）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將20只小鼠隨機(jī)分為植入組和對照組，每組10只。實(shí)驗(yàn)方法如下：將麻醉后的小鼠固定于手術(shù)板上，常規(guī)消毒，剪開背部皮膚；植入組將長1 cm、直徑2 mm 的圓柱形鎳鈦合金材料（約0.2 g）植入背部皮下，然后縫合皮膚；對照組剪開背部皮膚后直接縫合。術(shù)后第14 、21天兩組各取5只小鼠進(jìn)行如下檢測。

1.2.1 體質(zhì)量和主要免疫器官臟器系數(shù)

體質(zhì)量：每日測量1 次小鼠的體質(zhì)量。臟器質(zhì)量系數(shù)：術(shù)后第14、21 天兩組各處死5 只小鼠，用無菌剪刀和鑷子取出其脾臟和胸腺，除去多余的結(jié)締組織和脂肪后稱重并計(jì)算脾臟臟器系數(shù)（脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量）和胸腺臟器系數(shù)（胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量）。

1.2.2 脾臟和胸腺淋巴細(xì)胞亞群

術(shù)后第14、21 天，取小鼠脾臟，加入PBS 溶液研磨得到細(xì)胞混懸液，以1 000 r/min 離心5 min 后去除上清液；每管加入2 ml 紅細(xì)胞裂解液，裂解3 min，以1 000 r/min 離心5 min 后去除上清液；每管加入5 ml PBS 溶液重懸細(xì)胞，以1 000 r/min 離心5 min 后去除上清液，用PBS 溶液調(diào)節(jié)脾細(xì)胞濃度至1×107個(gè)/ml；將調(diào)節(jié)好濃度的脾細(xì)胞懸液加入各樣本的流式管（100 μl/管），并向各流式管加入相應(yīng)標(biāo)記抗體，充分混合均勻，室溫下避光反應(yīng)30 min；每管加入1 ml PBS 溶液重懸細(xì)胞，以1 000 r/min 離心5 min 后去除上清液；每管加入0.5 ml PBS 溶液重懸細(xì)胞后，采用流式細(xì)胞儀獲取數(shù)據(jù)。

處理小鼠胸腺時(shí)不加紅細(xì)胞裂解液，其他步驟與脾臟的處理步驟類似，最后采用流式細(xì)胞儀獲取數(shù)據(jù)。

1.2.3 血清IgM 和IgG

術(shù)后第14、21 天，于小鼠眼眶取血，制備血清；取100 μl 稀 釋 后 血 清（IgM：1 ∶10 000；IgG：1 ∶100 000）及標(biāo)準(zhǔn)品工作液，于37 ℃條件下孵育90 min；棄掉板內(nèi)液體后，立即加入100 μl 生物素化抗體工作液，于37 ℃孵育60 min，棄掉板內(nèi)液體，洗板3 次；每孔加入100 μl HRP 酶結(jié)合物工作液，于37 ℃孵育30 min，棄掉板內(nèi)液體，洗板5 次；每孔加入90 μl 底物溶液，于37 ℃孵育15 min 左右，使用Thermo MK3 酶標(biāo)儀在450 nm 波長下讀取數(shù)據(jù)。

1.2.4 血清Th1/Th2/Th17 細(xì)胞因子

術(shù)后第14、21 天，于小鼠眼眶取血收集于1.5 ml離心管中，室溫下靜置60 min，以3 000 r/min 離心10 min 后收集上層血清，于-20 ℃保存?zhèn)溆茫恢苽涮荻认♂尩臉?biāo)準(zhǔn)品工作液，制備捕獲微球和檢測抗體，在各流式管中加入50 μl 捕獲微球，分別在含有捕獲微球的各管中加入50 μl 標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，混勻，室溫條件下孵育1 h；每管加入50 μl PE Detection Reagent，輕輕混勻后室溫下避光孵育1 h；每管加入1.0 ml 清洗液Wash Buffer，以1 000 r/min離心5 min后去除上清液；每管加入300 μl Wash Buffer 重懸微球，采用流式細(xì)胞儀獲取數(shù)據(jù)；最后，導(dǎo)出FCS 數(shù)據(jù)文件，使用FCAP 軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量和主要免疫器官臟器系數(shù)

術(shù)后第14、21 天，兩組體質(zhì)量及脾臟、胸腺臟器系數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），見表1。

表1 兩組體質(zhì)量和主要免疫器官臟器系數(shù)比較（±s）

表1 兩組體質(zhì)量和主要免疫器官臟器系數(shù)比較（±s）

組別 只數(shù) 體質(zhì)量（g）術(shù)后第14 天 術(shù)后第21 天對照組 5 19.7±0.5 19.6±0.4植入組 5 19.0±0.7 20.1±0.6 t 0.833 0.723 P 0.152 0.426組別 只數(shù) 脾臟臟器系數(shù)術(shù)后第14 天 術(shù)后第21 天對照組 5 0.4628±0.0526 0.4760±0.0459植入組 5 0.4290±0.0457 0.4756±0.0414 t 0.338 0.986 P 0.064 0.974組別 只數(shù) 胸腺臟器系數(shù)術(shù)后第14 天 術(shù)后第21 天對照組 5 0.3234±0.0579 0.2599±0.0283植入組 5 0.3297±0.0274 0.2647±0.0593 t 0.754 0.690 P 0.252 0.437

2.2 脾臟和胸腺淋巴細(xì)胞亞群

術(shù)后第14 天，植入組的脾臟CD8+T 淋巴細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的比例高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)后第14 天，兩組脾臟CD3+、CD4+、CD19+和CD49b+淋巴細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的比例及胸腺各淋巴細(xì)胞亞群占比比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）；術(shù)后第21 天，兩組脾臟各淋巴細(xì)胞亞群占比及胸腺各淋巴細(xì)胞亞群占比比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；見圖1～4。

圖1 術(shù)后第14 天小鼠脾臟淋巴細(xì)胞亞群占比

圖2 術(shù)后第21 天小鼠脾臟淋巴細(xì)胞亞群占比

圖3 術(shù)后第14 天小鼠胸腺淋巴細(xì)胞亞群占比

圖4 術(shù)后第21 天小鼠胸腺淋巴細(xì)胞亞群占比

2.3 血清IgM 和IgG

術(shù)后第14、21 天，兩組IgM 和IgG 水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），見表2。

表2 兩組血清IgM 和IgG 水平比較（±s）

表2 兩組血清IgM 和IgG 水平比較（±s）

組別 只數(shù) IgM（μg/ml）IgG（mg/ml）術(shù)后第14 天 術(shù)后第21 天 術(shù)后第14 天 術(shù)后第21 天對照組 5 56.0±7.0 53.8±4.6 13.3±1.6 16.8±6.2植入組 5 61.4±16.3 58.2±6.8 16.6±3.1 16.3±4.7 t 0.693 0.958 2.175 0.139 P 0.524 0.392 0.118 0.897

2.4 血清Th1/Th2/Th17 細(xì)胞因子

術(shù)后第14 天，植入組血清干擾素（interferon，IFN）-γ 和白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-17A 水平高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩組其他細(xì)胞因子水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)后第21 天，兩組血清Th1/Th2/Th17 細(xì)胞因子水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；見圖5和圖6。

圖5 術(shù)后第14 天小鼠血清Th1/Th2/Th17 細(xì)胞因子水平

圖6 術(shù)后第21 天小鼠血清Th1/Th2/Th17 細(xì)胞因子水平

3 討論

鎳及其化合物對機(jī)體免疫系統(tǒng)的毒性效應(yīng)表現(xiàn)為對免疫應(yīng)答的抑制作用，包括抑制胸腺生長（導(dǎo)致胸腺質(zhì)量和大小下降、胸腺網(wǎng)狀細(xì)胞變性壞死、淋巴細(xì)胞輕度減少、胸腺髓質(zhì)疏松排列）[3]，抑制脾臟質(zhì)量和大小，減少紅白髓內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量[4]，并顯著降低外周血和免疫器官（胸腺、脾臟、回腸）中CD3+、CD3+/CD4+和CD3+/CD8+T 淋巴細(xì)胞的占比，以及抑制IL-2、IL-6、IL-10、IL-17、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 和IFN-γ mRNA 的表達(dá)[5]。在部分鎳鈦合金植入器械的臨床使用中，發(fā)現(xiàn)其對人體免疫功能存在一定的影響。一項(xiàng)針對植入鎳鈦合金封堵器的先天性心臟病患者的研究發(fā)現(xiàn)，患者體內(nèi)存在鎳離子析出現(xiàn)象，且析出濃度與封堵器的直徑呈正相關(guān)，析出的鎳離子影響了患者T 淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)，主要表現(xiàn)為CD3+、CD3+/CD4+T 淋巴細(xì)胞占比的下降[6]。另一項(xiàng)針對使用鎳鉻合金烤瓷冠患者的研究發(fā)現(xiàn)，尿鎳高水平組的血清IL-1β 水平顯著低于尿鎳低水平組[7]。雖然臨床上有使用鎳鈦合金植入器械影響人體免疫功能的報(bào)道，但目前在鎳鈦合金植入器械臨床應(yīng)用前的生物相容性評(píng)價(jià)中關(guān)于免疫毒性的研究較少。

本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)，相當(dāng)水平的鎳鈦合金植入未引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的全身毒性反應(yīng)[8]。本研究進(jìn)一步探討了鎳鈦合金材料對免疫系統(tǒng)的潛在影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鎳鈦合金材料植入術(shù)后第14 天，小鼠脾臟CD8+T 淋巴細(xì)胞占比升高，血清IFN-γ 和IL-17A 水平升高，且均于術(shù)后第21 天恢復(fù)正常，小鼠的主要免疫器官脾臟和胸腺的臟器系數(shù)及其余各淋巴細(xì)胞占比未見明顯變化，因此推測鎳離子析出對機(jī)體免疫功能的影響可能是暫時(shí)性的。

眾所周知，劑量決定毒性。引起機(jī)體免疫反應(yīng)的劑量具有特殊性，即一定劑量的免疫原才會(huì)誘發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)。一項(xiàng)針對鎳鈦合金的溶出特性研究發(fā)現(xiàn)，某鎳鈦合金材料（長1 cm，直徑2 mm，質(zhì)量0.2 g）以0.9%氯化鈉注射液為浸提介質(zhì)，按0.2 g/ml 浸提比例于37 ℃浸提72 h 后，其浸提液中鎳離子含量約0.002 mg/ml，是該研究使用的國內(nèi)外各品牌鎳鈦合金材料中鎳溶出量最多的[9]。為進(jìn)一步探討鎳離子劑量對免疫系統(tǒng)的影響，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究得到的鎳離子無明顯損害作用劑量（no observed adverse effect level，NOAEL）0.25 mg/（kg·d）[6]，選擇3 個(gè)劑量的氯化鎳溶液與弗氏完全佐劑等比例混合后注射至小鼠皮下（鎳離子暴露劑量分別為0.25、0.025、0.0025 mg/kg），第1、7、14 天免疫小鼠。末次免疫后24 h 檢測發(fā)現(xiàn)，0.25 mg/kg 和0.025 mg/kg 劑量組小鼠的NK 細(xì)胞（CD49）占比均低于佐劑對照組（分別降低45.3%和44.9%），0.0025 mg/kg 劑量組與佐劑對照組無顯著差異；末次免疫后1 周 檢測發(fā)現(xiàn)，0.25 mg/kg 和0.025 mg/kg 劑量組小鼠NK 細(xì)胞占比低于佐劑對照組（分別降低17.1%和20.8%），0.0025 mg/kg 劑量組與佐劑對照組無顯著差異；此外，NK 功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，末次免疫后24 h 0.025 mg/kg 劑量組小鼠脾NK細(xì)胞對K562細(xì)胞的抑制率（17.2%）低于佐劑對照組（22.4%）。以上結(jié)果說明，1/10 NOAEL鎳離子已經(jīng)對小鼠的固有免疫功能產(chǎn)生了影響，抑制了NK 細(xì)胞的表達(dá)。1/10 NOAEL按0.2 ml/只計(jì)算，其鎳離子暴露濃度約為0.0025 mg/ml，與本研究使用的鎳鈦合金材料的體外鎳溶出量相當(dāng)。但本研究卻未發(fā)現(xiàn)鎳鈦合金材料對NK 細(xì)胞占比的明顯影響，原因可能與機(jī)體的免疫狀態(tài)有關(guān)（植入實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭形词褂米魟?/p>

盡管本研究未觀察到不可逆的免疫系統(tǒng)變化，但是存在階段性的有關(guān)炎癥反應(yīng)的IFN-γ、IL-17A 水平升高，相當(dāng)劑量水平鎳離子引起的NK 細(xì)胞占比及功能的下降，這些變化是否會(huì)引起機(jī)體的免疫損傷值得進(jìn)一步研究。事實(shí)上，在許多鎳鈦合金植入器械臨床使用失敗的報(bào)道中，有鎳過敏史的患者的失敗率顯著高于普通患者[10-11]。因此，在鎳鈦合金植入器械使用過程中，需始終關(guān)注其對免疫系統(tǒng)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，并值得在鎳致敏的動(dòng)物模型上進(jìn)行更深入的研究和探討。