干擾素體外釋放酶聯(lián)免疫檢驗技術(shù)在結(jié)核病臨床診斷中的應(yīng)用價值分析

丁祥

鹽城市大豐人民醫(yī)院檢驗科，江蘇大豐 224000

結(jié)核病主要是由結(jié)核桿菌感染引起的慢性傳染病，在青年人中較為多見，潛伏期為4～8 周，80%的患者發(fā)生于肺部，患者常會出現(xiàn)低熱、乏力、咳嗽等癥狀，對其正常生活帶來極大困擾，威脅身體健康[1]。近年來，該病發(fā)病率逐漸呈上升趨勢，控制結(jié)核病的流行尤為重要[2]。對于此病，既往臨床主要采用細(xì)菌學(xué)檢測，但該方法耗時較長，敏感性較低，診斷效能無法滿足臨床需求。結(jié)核菌素皮膚過敏試驗為一種免疫學(xué)檢測方法，應(yīng)用較為廣泛，但易受非結(jié)核分枝桿菌感染、卡介苗接種的影響，假陽率較高。而干擾素體外釋放酶聯(lián)免疫檢驗技術(shù)（enzyme-linked immunosorbent assay for interferon release in vitro, ELIIGRA）為結(jié)核分枝復(fù)合群間接的免疫學(xué)篩查技術(shù)，操作簡單、設(shè)備儀器要求低、檢測周期短，應(yīng)用價值高[3]。但目前，臨床關(guān)于ELIIGRA 對結(jié)核病的臨床診斷價值鮮見報道。基于此，本文選擇2020年1 月—2022年11 月鹽城市大豐人民醫(yī)院收治的118 例疑似結(jié)核病患者，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院就診的疑似結(jié)核病患者118例，其中男82例、女36例；年齡12～86歲，平均（49.00±10.21）歲；體質(zhì)指數(shù)14～24 kg/m2，平均（19.00±1.12）kg/m2。本文研究已經(jīng)通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：可耐受本研究相關(guān)檢查；認(rèn)知功能、溝通能力良好；知情且簽署協(xié)議書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：有惡性腫瘤疾病者；肝、腎功能障礙者；合并慢性阻塞性肺病、支氣管哮喘、支氣管擴張等疾病者；合并免疫系統(tǒng)、感染性疾病者；近期使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等者；具有神經(jīng)系統(tǒng)疾病或病史、無法正常溝通交流者；臨床資料不完整者；依從性差者。

1.3 方法

1.3.1 結(jié)核菌素皮膚過敏試驗方法 應(yīng)用皮內(nèi)注射法，先吸0.1 mL 純蛋白衍生物（pure protein derivative, PPD）原液備用，再吸0.2 mL PPD 原液加入0.9%氯化鈉注射液稀釋至0.4 mL，以備使用。PPD用量：第1 次試驗液：每0.1 mL 中含有0.0001 mg。對注射部位進行常規(guī)消毒，于上肢前臂進行皮內(nèi)注射0.1 mL 標(biāo)準(zhǔn)PPD，2～3 d 后，觀察并記錄實驗結(jié)果。觀察局部是否有硬結(jié)，并記錄硬結(jié)直徑，取平均值作為最終值，直徑平均≥5 mm 為陽性，＜5 mm 為陰性。

1.3.2 ELIIGRA 試驗方法 應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點（enzyme-linked immunospot, ELISPOT）試劑（深圳市達科為生物技術(shù)公司），采集受試對象10 mL 靜脈血，應(yīng)用乙二胺四乙酸進行抗凝處理，2 h 內(nèi)將其血液標(biāo)本分離成為單個核細(xì)胞（peripheralbloodmononuclearcell, PBMC），洗滌2 次，于ELISPOT 培養(yǎng)板中預(yù)包被抗-IFN-γ 抗體，于板中各種加100 μL 的細(xì)胞懸液，每孔細(xì)胞數(shù)約為2.0×105個。在陽性對照孔內(nèi)，每孔加入濃度為5 μg/mL 的植物血凝素（phytohemagglutinin, PHA）；禁止在陰性對照孔各孔中添加刺激物。于實驗孔中加入濃度為5 μg/mL 的PoolB、ESAT-6、PoolA 等特異性抗原刺激物。之后將培養(yǎng)板放在溫度為37℃、含有5%CO2的培養(yǎng)箱中，持續(xù)培養(yǎng)16～24 h。2 h 后洗板，將生物素化的抗IFN-γ 加入并溫育1 h。應(yīng)用親和素標(biāo)記二抗，再持續(xù)孵育1 h，加底物液，顯色。顯色洗板后應(yīng)用自來水終止反應(yīng)，應(yīng)用ELISPOT 測定儀記錄斑點數(shù)。檢測結(jié)果（每孔斑點數(shù)排除陰性孔中斑點數(shù)）斑點數(shù)量≥30，為陽性；若PoolB、ESAT-6、PoolA 中≥1 種抗原結(jié)果為陽性，則結(jié)果為陽性；若3 種抗原測試結(jié)果均為陰性，則結(jié)果為陰性。

1.4 觀察指標(biāo)

以痰培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，對比分析兩種方法的診斷效能（靈敏性、特異性、準(zhǔn)確性）。

診斷準(zhǔn)確性=（真陽例數(shù)+真陰例數(shù)）/總例數(shù)×100%；診斷靈敏性=真陽/（真陽例數(shù)+假陰例數(shù)）×100%；診斷特異性=真陰例數(shù)/（真陰例數(shù)+假陽例數(shù)）×100%。

1.5 統(tǒng)計方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以[n(%)]表示，進行χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢查方法診斷結(jié)果

痰培養(yǎng)結(jié)果：118 例疑似患者中，陽性107 例、陰性11 例。結(jié)核菌素皮膚過敏試驗結(jié)果：真陽97例、假陽3 例、真陰8 例、假陰10 例；ELIIGRA 試驗結(jié)果：真陽105 例、假陽1 例、真陰10 例、假陰2 例。見表1。

表1 兩種檢查方法診斷結(jié)果

2.2 兩種檢查方法診斷效能對比

ELIIGRA 試驗的診斷準(zhǔn)確性、敏感性均高于結(jié)核菌素皮膚過敏試驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；兩種檢查方式診斷特異性對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.092）。見表2。

表2 兩種檢查方法診斷效能對比

3 討論

我國為結(jié)核病發(fā)病率較高的國家之一，患者總數(shù)居世界第二，并且感染者的數(shù)量不斷增加，嚴(yán)重降低了我國國民的生活質(zhì)量，威脅患者身體健康[4-6]。目前，在結(jié)核病的防治中，最大的難題仍為結(jié)核病的診斷問題，臨床上常采用臨床癥狀、影像學(xué)、病理學(xué)等多種手段聯(lián)合診斷，但多數(shù)患者缺乏典型的臨床及影像學(xué)表現(xiàn)，易出現(xiàn)漏診、誤診等情況，而病理學(xué)檢查中標(biāo)本取材困難，診斷難度高[7-8]。因此，及時尋求一種更安全、有效、簡便的診斷技術(shù)具有必要性。

徐寧等[9]學(xué)者報道發(fā)現(xiàn)，結(jié)核γ-干擾素酶聯(lián)免疫法釋放試驗結(jié)果與病理結(jié)果具有較高的一致性。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核菌素皮膚過敏試驗結(jié)果：真陽97 例、假陽3 例、真陰8 例、假陰10 例；ELIIGRA試驗結(jié)果：真陽105 例、假陽1 例、真陰10 例、假陰2 例。與結(jié)核菌素皮膚過敏試驗相比，ELIIGRA 試驗的診斷準(zhǔn)確性、靈敏性更高（P＜0.05）。張青卿等人[10]研究數(shù)據(jù)顯示，結(jié)核γ-干擾素釋放試驗診斷肺結(jié)核的符合率為88.76%。本文數(shù)據(jù)顯示，ELIIGRA 診斷結(jié)核病的準(zhǔn)確率為97.46%。這與張青卿等學(xué)者報道一致。提示ELIIGRA 對肺結(jié)核的診斷效能較好。主要是因為，結(jié)核菌素試驗為臨床常用的檢測結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis, MTB）的免疫學(xué)方法，但其檢測結(jié)果會受到非MTB 感染、卡介苗接種的影響，且我國卡介苗接種率比較高，導(dǎo)致結(jié)核菌素試驗檢查的假陽性風(fēng)險較高，影響診斷效能[11-12]。而ELIIGRA 為一種新的免疫學(xué)方法，主要通過體外釋放酶聯(lián)免疫技術(shù)，對全血中MTB 記憶性T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的γ干擾素濃度進行檢測，該方法主要應(yīng)用缺失區(qū)域1，有2 種基因的重組抗原刺激MTB 感染者特異性T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生γ 干擾素，具有較強的特異性，還不會受卡介苗接種、非MTB 的干擾，診斷效能較高[13-14]。且ELIIGRA 操作簡單快捷、對設(shè)備及儀器的要求也較低，檢測的周期短，可快速、準(zhǔn)確做出診斷[15-16]。但本文還發(fā)現(xiàn)，ELIIGRA 診斷也出現(xiàn)了假陽性、假陰性的情況，這可能是因為操作流程中有細(xì)菌污染實驗，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。

綜上所述，對于結(jié)核病患者采用干擾素體外釋放酶聯(lián)免疫檢驗技術(shù)的診斷準(zhǔn)確性較高，可早期準(zhǔn)確診斷出此病，便于及時進行治療，臨床應(yīng)用價值顯著。