不同劑量養心通脈有效部位方對心肌缺血再灌注損傷模型大鼠心肌線粒體代謝相關酶及其轉運的影響

尹夢影，曹偉，胡鑫，鄭景輝，莫云秋

研究顯示，冠心病是心血管疾病的首要死亡原因，其主要治療方式是對心肌進行早期再灌注［1-2］。而再灌注可導致心肌線粒體功能紊亂，進而損傷心功能。心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）指心肌血供短暫中斷后又迅速恢復正常，導致心肌能量代謝障礙、心肌細胞結構改變等進一步加重的現象［3］，故修復受損的線粒體是其重要的治療手段。養心通脈方是由我國著名中醫學家秦伯未先生運用“扶養心氣，和通血脈”之法治療胸痹心痛的有效名方，而養心通脈有效部位方（active principle region of Yangxin Tongmai formula，apr-YTF）能促進心肌線粒體的修復，其有效成分——人參皂苷、丹參酮ⅡA、總生物堿、人參多糖、復方多糖、總揮發油等與養心通脈方相似［4］。但與養心通脈方相比，apr-YTF中的活性成分更加豐富，其可以降低用藥劑量，提高抗MIRI的療效［5］。本研究旨在分析不同劑量apr-YTF對MIRI模型大鼠心肌線粒體代謝相關酶及其轉運的影響，以期為采用apr-YTF防治MIRI提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 本實驗時間為2020年6月至2021年6月。

1.2 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠95只，體質量為180～220 g，購自廣西中醫藥大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（湘）2019-0013。大鼠在SPF級實驗中心常規飼養，飼養條件如下：5只大鼠為一籠，溫度控制在22～25 ℃，相對濕度為35%，大鼠自由飲水，常規飼料，不限制進食，實驗室燈光為12 h/12 h日夜交替。

1.3 實驗藥物 apr-YTF由人參20 g、桂枝15 g、生地15 g、丹參25 g、澤瀉10 g組成，統一由廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院采購，藥材均為同一批次。將方劑放入圓底燒瓶內煎煮，首煎加8倍水，煮45 min；二煎加4倍水，煮30 min；攪拌均勻后用武火燒開，制成apr-YTF。冠心蘇合丸由北京同仁堂科技發展股份有限公司中藥廠生產（批號：Z11021184，每10丸8.5 mg）。

1.4 實驗儀器與試劑 病理組織切片機購自Thermo Fisher Scientific公司，光學顯微鏡購自OLYMPUS，動物心電監護儀購自美國SurgiVet公司，小動物呼吸機、小動物麻醉機及手術器械購自Harvard Bioscience公司，全自動血液細胞分析儀購自上海涵飛醫療器械有限公司，KE-300S血液流變儀購自上海康美國際生化有限公司，Tecan Infinite 200Pro酶標儀購自上海迪奧生物科技有限公司，1658033型電泳儀、電轉儀和電源購自美國Bio-Rad公司。

注射用青霉素鈉購自華北制藥股份有限公司，異氟烷購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司，4%多聚甲醛通用型組織固定液購自Biosharpa；蘇木素、伊紅染色試劑購自上海藍季科技發展有限公司，肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzymes，CK-MB）、心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、磷酸果糖激酶1（phosphofructokinase 1，PFK1）、琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）、腺苷酸轉運體（adenine nucleotide translocator，ANT）、異枸櫞酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）ELISA試劑盒及ATP含量生化試劑盒購自江蘇酶免實業有限公司，腫瘤壞死因子α誘導蛋白2（tumor necrosis factor alpha-induced protein 2，TNFαIP2）抗體購自武漢貝茵萊生物科技有限公司（Bioswamp），MIRO1抗體購自NOVUS公司。

1.5 實驗方法

1.5.1 分組及干預方法 將70只健康雄性Wistar大鼠隨機分為空白對照組、模型組、陰性對照組、陽性對照組及apr-YTF低、中、高劑量組，每組10只。除空白對照組外，其他組大鼠構建MIRI模型，具體方法為：將大鼠采用仰臥位固定于手術臺，采用異氟烷進行持續呼吸麻醉，待大鼠呼吸平穩后，連接動物心電監護儀，實時觀測心電圖變化情況；將大鼠經背位固定，充分暴露氣管后進行氣管插管，并連接小動物呼吸機，大鼠呼吸頻率與呼吸機一致表明氣管插管成功；于胸前左側第3～4肋備皮消毒，逐層剝離并充分暴露心臟，于左心耳下緣用7-0 mm可吸收線結扎左冠狀動脈前降支，結扎完成后將心臟迅速放回胸腔內；結扎30 min后進行再灌注2 h。心電圖導聯ST段弓背向上抬高說明造模成功。縫合胸壁，待大鼠呼吸頻率穩定后暫停機械通氣以恢復其自主呼吸。如無異常，將大鼠放回干凈籠內，密切觀察大鼠生命體征。術后常規應用注射用青霉素鈉3 d以預防感染。造模期間，各組大鼠共死亡25只，為保證實驗完整性，補充造模至每組10只。造模完成后，空白對照組及模型組大鼠正常飼養，陰性對照組大鼠給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，陽性對照組大鼠給予冠心蘇合丸灌胃，apr-YTF低、中、高劑量組大鼠分別給予1.5、3.0、6.0 ml apr-YTF灌胃〔以成年人體質量60 kg為標準，根據實驗動物劑量換算方法計算給藥量，大鼠給藥量（g/kg）=成人給藥量（g/kg）×6.3〕，1次/d，不限制飲水、進食，分籠飼養，共干預2周。

1.5.2 血液流變學指標、血清心肌梗死標志物水平檢測方法 造模24 h后，從空白對照組與模型組中隨機選取3只大鼠，采用5%水合氯醛（0.01 ml/g）腹腔注射進行麻醉，待大鼠疼痛反射消失后采集其腹主動脈血液5 ml，室溫靜置2 h后4 000 r/min離心15 min（離心半徑8.6 cm），取上清液備用。采用KE-300S血液流變儀檢測血液流變學指標，包括全血低切、中切、高切黏度，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。采用ELISA檢測血清心肌梗死標志物水平，包括CK-MB、cTnI、LDH水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5.3 心肌組織病理學檢查 造模第14天，隨機選取各組大鼠3只，采用5%水合氯醛（0.01 ml/g）腹腔注射進行麻醉；待大鼠疼痛反射消失后剪開胸腔，取出心臟，采用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，使用4%多聚甲醛通用型組織固定液固定標本；取適量心肌組織并采用10%多聚甲醛溶液浸泡過夜，采用PBS清洗，進行乙醇梯度脫水、二甲苯透明，放入蠟塊浸漬，采用病理組織切片機將蠟塊切成3～5 μm的薄片，將切片放于熱水上，將石蠟融化展于玻片上，封固，采用蘇木素、伊紅染色試劑進行染色；將玻片置于光學顯微鏡下，觀察心肌組織病理學變化情況。

1.5.4 線粒體代謝相關酶水平檢測方法 造模第14天，隨機選取各組大鼠6只，采用5%水合氯醛（0.01 ml/g）腹腔注射進行麻醉，待大鼠疼痛反射消失后采集腹主動脈血液5 ml；室溫靜置2 h后4 000 r/min離心15 min（離心半徑8.6 cm），取上清液備用。采用比色法檢測ATP水平，采用ELISA檢測PFK1、SDH、ANT、IDH水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5.5 心肌組織中TNFαIP2、MIRO1表達水平檢測方法 造模第14天，隨機選取各組大鼠3只，采用5%水合氯醛（0.01 ml/g）腹腔注射進行麻醉，待大鼠疼痛反射消失后剪開胸腔，取出心臟，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，使用4%多聚甲醛通用型組織固定液固定標本；取適量左心室心肌組織，用液氮快速冷凍，于-80 ℃環境下保存備用；采用Western blot法檢測心肌組織中TNFαIP2、MIRO1表達水平，方法如下：采用裂解液于冰上裂解心肌組織，研磨后14 000 r/min離心3 min（離心半徑10 cm），取上清液；進行蛋白定量及變性、電泳、轉膜、封閉、TBST洗滌，加入TNFαIP2及MIRO1一抗（1∶1 000）孵育過夜，加入二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，進行ECL顯影；采用Image J軟件進行條帶灰度分析，以目標蛋白與β-actin的比值作為目標蛋白表達水平。

1.6 統計學方法 采用Graphpad Prism 8.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血液流變學指標、血清心肌梗死標志物水平 模型組全血低切、中切黏度及血清CK-MB、cTnI、LDH水平高于空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；空白對照組與模型組全血高切黏度比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 空白對照組與模型組血液流變學指標、血清心肌梗死標志物水平比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of hemorheology indexes and serum myocardial infarction marker levels between blank control group and model group

表1 空白對照組與模型組血液流變學指標、血清心肌梗死標志物水平比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of hemorheology indexes and serum myocardial infarction marker levels between blank control group and model group

注：CK-MB=肌酸激酶同工酶，cTnI=心肌肌鈣蛋白I，LDH=乳酸脫氫酶

組別血液流變學指標（mPa·s）血清心肌梗死標志物全血低切黏度全血中切黏度全血高切黏度CK-MB（ng/ml）cTnI（ng/L）LDH（ng/L）空白對照組27.7±2.26.3±0.44.6±0.316.1±2.2447.3±65.123.4±3.9模型組41.3±6.27.6±0.74.9±0.227.0±2.0662.9±56.332.9±1.5 t值4.6693.4701.86410.9807.5126.783 P值0.0160.0080.099＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 心肌組織病理學檢查 空白對照組大鼠心肌組織結構完整，心肌纖維組織整齊有序，細胞核形態正常；模型組大鼠心肌纖維斷裂，排列紊亂，大量細胞核分布于細胞外，心肌間質中可見炎癥細胞浸潤、水腫；陰性對照組可見心肌纖維斷裂；與模型組相比，陽性對照組及apr-YTF低、中、高劑量組心肌水腫明顯減輕，炎癥細胞數量明顯減少，見圖1。

圖1 七組大鼠心肌組織病理學檢查結果（HE染色，×20）Figure 1 Histopathology examination results of myocardium in seven groups

2.3 線粒體代謝相關酶水平 七組ATP、PFK1、SDH、ANT、IDH水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。模型組ATP水平低于空白對照組，模型組、陰性對照組PFK1、SDH、ANT、IDH水平高于空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；陰性對照組、陽性對照組及apr-YTF低、中、高劑量組ATP水平高于模型組，陽性對照組及apr-YTF中、高劑量組PFK1、ANT、IDH水平低于模型組，陽性對照組及apr-YTF低、中、高劑量組SDH水平低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）；apr-YTF低劑量組ATP、ANT水平高于陽性對照組，apr-YTF低、中劑量組PFK1、IDH水平高于陽性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；apr-YTF中劑量組ATP水平低于apr-YTF低劑量組，apr-YTF中、高劑量組PFK1、ANT、IDH水平低于apr-YTF低劑量組，apr-YTF高劑量組SDH水平低于apr-YTF低劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 七組線粒體代謝相關酶水平比較（±s，n=6）Table 2 Comparison of mitochondrial metabolism-related enzyme levels in seven groups

表2 七組線粒體代謝相關酶水平比較（±s，n=6）Table 2 Comparison of mitochondrial metabolism-related enzyme levels in seven groups

注：PFK1=磷酸果糖激酶1，SDH=琥珀酸脫氫酶，ANT=腺苷酸轉運體，IDH=異枸櫞酸脫氫酶，apr-YTF=養心通脈有效部位方；a表示與空白對照組比較，P＜0.05；b表示與模型組比較，P＜0.05；c表示與陽性對照組比較，P＜0.05；d表示與apr-YTF低劑量組比較，P＜0.05

組別ATP（U/mg）PFK1（U/L）SDH（U/mg）ANT（pg/ml）IDH（U/L）空白對照組2.6±0.656.2±13.6154.0±17.4127.7±15.216.3±2.5模型組0.7±0.1a202.0±28.0a276.7±26.7a338.2±40.8a64.7±7.5a陰性對照組3.3±0.6b202.6±14.5a272.8±49.4a344.9±20.2a67.3±3.6a陽性對照組1.6±0.8b101.9±41.5b198.4±34.9b198.2±51.7b32.3±13.2b apr-YTF低劑量組2.5±0.7bc176.7±27.4c226.9±39.5b308.8±41.8c58.5±9.1c apr-YTF中劑量組1.7±0.4bd137.8±25.6bcd206.2±37.6b243.7±37.6bd43.6±8.6bcd apr-YTF高劑量組1.8±0.7b125.1±31.9bd181.3±31.3bd228.9±50.0bd41.7±10.3bd F值23.4946.6220.2750.2056.22 P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.4 心肌組織中TNFαIP2、MIRO1表達水平 七組心肌組織中TNFαIP2、MIRO1表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。模型組、陰性對照組心肌組織中TNFαIP2表達水平高于空白對照組，心肌組織中MIRO1表達水平低于空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；陽性對照組及apr-YTF中、高劑量組心肌組織中TNFαIP2表達水平低于模型組，陽性對照組及apr-YTF低、中、高劑量組心肌組織中MIRO1表達水平高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）；apr-YTF低劑量組心肌組織中TNFαIP2表達水平高于陽性對照組，apr-YTF低、中、高劑量組心肌組織中MIRO1表達水平低于陽性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；apr-YTF中、高劑量組心肌組織中TNFαIP2表達水平低于apr-YTF低劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 七組心肌組織中TNFαIP2、MIRO1表達水平比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of expression levels of TNFαIP2 and MIRO1 in myocardial tissue in seven groups

表3 七組心肌組織中TNFαIP2、MIRO1表達水平比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of expression levels of TNFαIP2 and MIRO1 in myocardial tissue in seven groups

注：TNFαIP2=腫瘤壞死因子α誘導蛋白2；a表示與空白對照組比較，P＜0.05；b表示與模型組比較，P＜0.05；c表示與陽性對照組比較，P＜0.05；d表示與apr-YTF低劑量組比較，P＜0.05

組別TNFαIP2MIRO1空白對照組0.37±0.110.99±0.07模型組1.11±0.08a0.75±0.11a陰性對照組0.99±0.15a0.72±0.08a陽性對照組0.64±0.06b1.23±0.07b apr-YTF低劑量組1.10±0.11c0.98±0.05bc apr-YTF中劑量組0.52±0.03bd1.05±0.06bc apr-YTF高劑量組0.49±0.04bd1.06±0.02bc F值35.1420.09 P值＜0.001＜0.001

3 討論

線粒體是決定心肌細胞生存率的重要因素，而心肌缺血缺氧會損傷線粒體功能，進而影響心肌細胞的正常運轉，因而線粒體功能與MIRI息息相關［6］。MIRI期間心肌的缺血缺氧會導致心肌細胞內的線粒體產生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），從而導致鈣超載、氧化應激等［7］，在這些因素協同作用下機體發生線粒體膜電位紊亂、細胞中ATP生成減少、糖酵解反應增強以及氧化磷酸化解偶聯［8］，其實質是三大物質代謝紊亂導致心肌能量發生改變，主要表現為脂肪酸的β氧化轉向糖酵解，導致心肌障礙、心臟超微結構及功能的異常［9］。研究表明，心肌能量代謝被破壞以及線粒體功能障礙與心肌重塑相關，而減少缺血再灌注對線粒體的損傷是提高心肌缺血患者治療效果、改善其預后的重要措施［10］。養心通絡方具有“扶養心氣，和通血脈”的作用，其最早在1989年被用于治療冠心病心絞痛［11］。臨床研究表明，養心通絡方治療冠心病心絞痛的有效率較高［4］。本課題組前期研究表明，apr-YTF不僅具有明顯的抗心肌缺血、加快血液流動速率、抗動脈粥樣硬化的作用，而且對于線粒體損傷有一定的修復作用［12］。本研究旨在分析不同劑量apr-YTF對MIRI模型大鼠心肌線粒體代謝相關酶及其轉運的影響。

在血液流變學中，血漿黏度指標中的任何一項高于參考范圍即可判定為血液流變學異常。心肌受損后機體的泵血功能會發生改變，血流速度減慢并處于高凝狀態［13］。血清CK-MB、cTnI、LDH是反映心肌壞死的標志物，對于判斷病情的嚴重程度和預后極為重要。研究表明，MIRI模型大鼠心肌細胞膜的通透性增大，從而釋放大量CK-MB、LDH和cTnI到血清中，進而加重大鼠心肌缺血缺氧［14］。本研究結果顯示，模型組全血低切、中切黏度及血清CK-MB、cTnI、LDH水平高于空白對照組，提示模型組大鼠血液處于高凝狀態，且心肌受損，再次驗證MIRI模型構建成功。

本研究心肌組織病理學檢查結果顯示，空白對照組大鼠心肌組織結構完整，心肌纖維組織整齊有序，細胞核形態正常；模型組大鼠心肌纖維斷裂，排列紊亂，大量細胞核分布于細胞外，心肌間質中可見炎癥細胞浸潤、水腫；陰性對照組可見心肌纖維斷裂；與模型組相比，陽性對照組及apr-YTF低、中、高劑量組心肌水腫明顯減輕，炎癥細胞數量明顯減少；提示apr-YTF可減輕MIRI模型大鼠的心肌損傷程度。

研究顯示，心肌長時間缺氧可導致線粒體相關代謝酶活性降低、ATP耗竭及心肌收縮功能受損；無氧條件下機體主要通過糖酵解產生ATP，因此，在心肌缺血缺氧期間，心肌的能量來源主要依靠糖酵解［15］。而PFK是糖酵解過程中的關鍵酶［16］。SDH和IDH是有氧氧化的關鍵酶，不僅可反映有氧氧化水平，還可反映心肌線粒體相關代謝酶活性［17］。ANT在線粒體能量生成及利用的過程中發揮著關鍵作用，其影響著整個細胞能量代謝的全過程［18］。本研究結果顯示，模型組ATP水平低于空白對照組，PFK1、SDH、ANT、IDH水平高于空白對照組，提示MIRI模型大鼠存在線粒體能量代謝功能障礙。本研究結果還顯示，陽性對照組及apr-YTF低、中、高劑量組ATP水平高于模型組，SDH水平低于模型組；陽性對照組及apr-YTF中、高劑量組PFK1、ANT、IDH水平低于模型組；提示不同劑量apr-YTF均可有效減輕MIRI模型大鼠線粒體能量代謝功能障礙。此外，apr-YTF中、高劑量組PFK1、ANT、IDH水平低于apr-YTF低劑量組，apr-YTF高劑量組SDH水平低于apr-YTF低劑量組，而apr-YTF中、高劑量組ATP、PFK1、SDH、ANT、IDH水平比較差異無統計意義，提示中劑量（3.0 ml）、高劑量（6.0 ml）apr-YTF減輕MIRI模型大鼠線粒體能量代謝功能障礙的效果相似，且優于低劑量（1.5 ml）apr-YTF。

心肌缺血再灌注時過度的氧化應激可使細胞內ROS增多和細胞膜的通透性增大，從而導致線粒體功能障礙［16］。心肌發生急性炎癥反應時會釋放大量的TNFαIP2，同時產生大量的ROS自由基，從而損傷線粒體內膜［19］。MIRO1為線粒體銜接蛋白，定位于線粒體外膜上，線粒體損傷后MIRO1發生磷酸化和泛素降解使受損的線粒體與微管分離，從而誘導線粒體功能障礙［20］。本研究結果顯示，模型組心肌組織中TNFαIP2表達水平高于空白對照組，MIRO1表達水平低于空白對照組，提示MIRI模型大鼠可能存在線粒體轉運障礙；陽性對照組及apr-YTF中、高劑量組心肌組織中TNFαIP2表達水平低于模型組，陽性對照組及apr-YTF低、中、高劑量組心肌組織中MIRO1表達水平高于模型組，apr-YTF中、高劑量組心肌組織中TNFαIP2表達水平低于apr-YTF低劑量組，而apr-YTF中、高劑量組心肌組織中TNFαIP2、MIRO1表達水平比較差異無統計學意義，提示不同劑量apr-YTF均可有效減輕MIRI模型大鼠線粒體轉運障礙，且中劑量（3.0 ml）、高劑量（6.0 ml）apr-YTF的效果相似，均優于低劑量（1.5 ml）apr-YTF。

綜上所述，不同劑量apr-YTF均可有效改善MIRI模型大鼠心肌線粒體代謝相關酶，進而減輕線粒體能量代謝功能障礙，其還可減輕線粒體轉運障礙；且中劑量（3.0 ml）、高劑量（6.0 ml）apr-YTF的效果相似，均優于低劑量（1.5 ml）apr-YTF。但本研究為基礎實驗，樣本量較小，尚需要大樣本量的臨床試驗進一步驗證本研究結論。

作者貢獻：尹夢影進行研究的構思與設計、實施與可行性分析，論文撰寫及修訂，數據分析；曹偉、胡鑫進行數據收集；鄭景輝、莫云秋負責質量控制及審校；莫云秋對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。