腸道菌群易位與老年糖尿病患者發生主要不良心血管事件的關系研究

陸水英，湯之明，陳力行，劉琳

糖尿病是心血管疾病的主要危險因素，而心血管疾病是老年糖尿病患者最常見的死亡原因［1］。因此，闡明老年糖尿病患者發生心血管事件的病理生理學機制及尋找新的生物標志物或靶點十分必要。研究表明，腸道微生物群可參與慢性病（如炎癥性腸病、肝硬化、關節炎和2型糖尿病）的發生發展［2］，如紊亂的腸道微生物群與大鼠心肌梗死易感性有關［3］。此外，從腸腔逸出的微生物代謝產物三甲胺N-氧化物（trimethylamine N-oxide，TMAO）進入體循環后可通過觸發單核細胞募集而激活免疫炎癥反應［4］。但少有研究探討腸道菌群及其代謝產物在糖尿病心血管事件中的作用。本研究假設糖尿病導致機體腸道屏障功能衰竭和腸道黏膜通透性增加，促使腸道細菌及其代謝產物易位進入全身循環，從而過度激活免疫炎癥反應并增加患者心血管事件發生風險。為此，本研究招募了50例健康對照者和100例老年糖尿病患者，通過宏基因組測序分析其全身微生物組，進而分析腸道菌群易位與老年糖尿病患者發生主要不良心血管事件（major adverse cardiac events，MACE）的關系，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2019年1月至2021年1月在肇慶市第一人民醫院治療的100例老年糖尿病患者作為研究對象，其均接受至少6個月的降血糖治療。根據隨訪期間患者是否發生MACE將其分為MACE（+）組23例和MACE（-）組77例。另選取同期在肇慶市第一人民醫院接受健康體檢的非糖尿病者50例作為對照組。本研究經肇慶市第一人民醫院倫理委員會審查通過（倫審2018-055-03），所有受試者簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準 納入標準：（1）年齡≥65歲；（2）臨床資料完整。排除標準：合并腫瘤等嚴重疾病或嚴重外傷者。

1.3 觀察指標 （1）全身微生物組多樣性指標。使用十六烷基三甲基溴化銨法從三組受試者血液樣本中提取基因組DNA，然后將基因組DNA稀釋至1 ng/μl作為模板，以16 S V4區域作為靶標進行擴增。引物序列：515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTCHVGGGTWTCTAAT-3'）。使用Phusion High-Fidelity PCR Master Mix進行PCR，通過Thermo Scientific試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）將PCR產物進行純化。使用Thermo Fisher Scientific公司生產的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒構建DNA文庫，并進行Qubit定量和文庫測試，然后使用Ion S5TM或Ion S5TMXL測序平臺進行測序。使用Cutadapt V1.9.1軟件獲得原始數據，然后再進行質控過濾以獲得有效數據。使用UPARSE軟件對所有有效堿基進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析。采用QIIME 1.9.1軟件計算血液樣本的OUT總數和香農指數，使用R軟件進行主坐標分析以挖掘三組受試者血液細菌特征的差異。（2）血漿腸道菌群百分比。記錄三組受試者血漿腸道菌群百分比。（3）收集MACE（+）組和MACE（-）組患者臨床資料、實驗室檢查指標及左心室射血分數（left ventricle ejection fraction，LVEF），其中臨床資料包括性別、年齡、BMI、吸煙情況、高血壓發生情況及用藥情況，實驗室檢查指標包括空腹血糖、總膽固醇、三酰甘油、白細胞計數、單核細胞計數、估算腎小球濾過率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）、超敏C反應蛋白（high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP）、CD14+CD16+單核細胞計數及血漿TMAO、D-乳酸。并計算ΔCD14+CD16+單核細胞計數、ΔTMAO、ΔD-乳酸，以反映CD14+CD16+單核細胞計數、TMAO、D-乳酸變化情況，ΔCD14+CD16+單核細胞計數=CD14+CD16+單核細胞計數發病第2天-CD14+CD16+單核細胞計數發病第1天，ΔTMAO=TMAO發病第2天-TMAO發病第1天，ΔD-乳酸=D-乳酸發病第2天-D-乳酸發病第1天。然后基于ΔTMAO和ΔD-乳酸構建一個新的變量——Z評分，首先計算ΔTMAO和ΔD-乳酸的Z分數，計算公式：Z分數 = （x-μ）/σ，其中x為需要標準化的原始分數，μ為平均值，σ為標準偏差，然后將ΔTMAO和ΔD-乳酸Z分數的平均值作為Z評分。

1.4 隨訪 所有患者進行電話隨訪和門診隨訪，主要終點事件為MACE（包括急性非致死性心肌梗死、急性缺血性腦卒中、心源性死亡及血運重建），隨訪截止時間為2022年3月。

1.5 統計學方法 應用SPSS 22.0軟件進行數據處理。符合正態分布的計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗；不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗；ΔTMAO、ΔD-乳酸與ΔCD14+CD16+單核細胞計數的相關性分析采用Spearman秩相關分析；老年糖尿病患者發生MACE的影響因素分析采用多因素Cox比例風險回歸分析，繪制ROC曲線以評估ΔTMAO、ΔD-乳酸、Z評分及Z評分+hs-CRP+CD14+CD16+單核細胞計數對老年糖尿病患者發生MACE的預測價值。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對照組、MACE（-）組及MACE（+）組全身微生物組多樣性指標和血漿腸道菌群百分比 對照組、MACE（-）組及MACE（+）組OTU總數、香農指數及血漿腸道菌群百分比比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；MACE（+）組OTU總數、香農指數及血漿腸道菌群百分比均高于對照組和MACE（-）組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。主坐標分析結果顯示，MACE（+）組血液細菌特征與對照組或MACE（-）組明顯分開（P值均 ＜ 0.001），見圖1。

圖1 三組血液細菌特征的主坐標分析結果Figure 1 Results of principal coordinate analysis of three groups of blood bacterial characteristics

表1 對照組、MACE（-）組及MACE（+）組OTU總數、香農指數及血漿腸道菌群百分比比較（±s）Table 1 Comparison of total number of OTU，Shannon index and percentage of plasma intestinal flora in control group，MACE（-）group and MACE（+）group

表1 對照組、MACE（-）組及MACE（+）組OTU總數、香農指數及血漿腸道菌群百分比比較（±s）Table 1 Comparison of total number of OTU，Shannon index and percentage of plasma intestinal flora in control group，MACE（-）group and MACE（+）group

注：MACE=主要不良心血管事件，OTU=操作分類單元；a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與MACE（-）組比較，P＜0.05

組別例數OTU總數香農指數血漿腸道菌群百分比（%）對照組501 488±1042.62±0.268.26±0.54 MACE（-）組771 105±1322.41±0.228.42±0.35 MACE（+）組231 587±140ab3.26±0.28ab10.77±0.61ab F值3.1463.3154.035 P值0.0290.0200.005

2.2 MACE（-）組和MACE（+）組臨床資料、實驗室檢查指標及LVEF比較 MACE（-）組和MACE（+）組女性占比、年齡、BMI、吸煙率、高血壓發生率、空腹血糖、總膽固醇、三酰甘油、白細胞計數、單核細胞計數、eGFR及胰島素、口服降糖藥、阿司匹林、他汀類藥物、鈣通道阻滯劑、ACEI/ARB使用率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；MACE（+）組hs-CRP、CD14+CD16+單核細胞計數、TMAO、D-乳酸、ΔCD14+CD16+單核細胞計數、ΔTMAO、ΔD-乳酸及Z評分高于MACE（-）組，LVEF低于MACE（-）組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 MACE（-）組和MACE（+）組臨床資料、實驗室檢查指標及LVEF比較Table 2 Comparison of clinical data，laboratory examination indexes and LVEF between MACE（-）group and MACE（+）group

2.3 老年糖尿病患者發生MACE影響因素的多因素Cox比例風險回歸分析 將老年糖尿病患者是否發生MACE（賦值：否=0，是=1）作為因變量，排除存在多重共線性的指標后，將hs-CRP（賦值：＞2.64 mg/L=1，≤2.64 mg/L=0）、CD14+CD16+單核細胞計數（賦值：＞25.8細胞/μl=1，≤25.8細胞/μl=0）、Z評分（賦值：＞0.71=1，≤0.71=0）、LVEF（賦值：＞50%=0，≤50%=1）作為自變量，采用向前逐步選擇法，進行多因素Cox比例風險回歸分析，結果顯示，hs-CRP、CD14+CD16+單核細胞計數、Z評分是老年糖尿病患者發生MACE的獨立影響因素（P＜0.05），見表3。

表3 老年糖尿病患者發生MACE影響因素的多因素Cox比例風險回歸分析Table 3 Multivariate Cox proportional hazard regression analysis of influencing factors of MACE in elderly patients with diabetic mellitus

2.4 ROC曲線 ROC曲線分析結果顯示，ΔTMAO、ΔD-乳酸、Z評分、Z評分+hs-CRP+CD14+CD16+單核細胞計數預測老年糖尿病患者發生MACE的AUC分別為0.647〔95%CI（0.533，0.761）〕、0.630〔95%CI（0.527，0.725）、0.681〔95%CI（0.567，0.794）、0.822〔95%CI（0.738，0.906），見表4。

表4 ΔTMAO、ΔD-乳酸、Z評分及Z評分+hs-CRP+CD14+CD16+單核細胞計數對老年糖尿病患者發生MACE的預測價值Table 4 Predictive value of ΔTMAO，ΔD-lactic acid，Z score and Z score+hs-CRP+CD14+CD16+ monocyte count for MACE in elderly patients with diabetic mellitus

2.5 相關性分析 Spearman秩相關分析結果顯示，ΔTMAO與老年糖尿病患者ΔCD14+CD16+單核細胞計數呈正相關（rs=0.200，P=0.047）；ΔD-乳酸與老年糖尿病患者ΔCD14+CD16+單核細胞計數無直線相關關系（rs=0.119，P＞0.05）。ΔTMAO和ΔD-乳酸與MACE（+）組患者ΔCD14+CD16+單核細胞計數呈正相關（rs值分別為 0.322、0.290，P值分別為0.028、0.048）。

3 討論

研究表明，約有1012種細菌定植在人類胃腸道，其中機會性病原體有109種［5］。本研究結果顯示，MACE（+）組OTU總數、香農指數及血漿腸道菌群百分比均高于對照組和MACE（-）組；主坐標分析結果顯示，MACE（+）組血液細菌特征與對照組或MACE（-）組明顯分開，提示發生MACE的老年糖尿病患者全身微生物組與未發生MACE的老年糖尿病患者和對照者不同，其主要表現為全身微生物組多樣性增加，而腸道菌群可能是導致全身微生物組多樣性增加的主要原因。

TMAO和D-乳酸是腸道菌群的代謝產物，二者均被認為是腸道菌群易位和腸道黏膜通透性增加的標志物［6］。臨床研究表明，TMAO與糖尿病患者發生心血管并發癥有關［7］。在糖尿病患者中，TMAO是其發生心血管事件的重要標志物［8］。此外，TMAO水平升高的糖尿病患者心血管疾病風險和主要心臟事件發生率升高［9］。血漿TMAO水平升高與舒張功能障礙發生率和死亡率增加有關［10］。本研究結果顯示，MACE（+）組TMAO、ΔTMAO高于MACE（-）組。D-乳酸是腸道屏障喪失和腸道黏膜通透性增加的標志物［11］。本研究結果顯示，MACE（+）組D-乳酸和ΔD-乳酸高于MACE（-）組；多因素Cox比例風險回歸分析結果顯示，hs-CRP、CD14+CD16+單核細胞計數、Z評分是老年糖尿病患者發生MACE的獨立影響因素，提示腸道菌群易位是老年糖尿病患者發生MACE的影響因素。

ROC曲線分析結果顯示，ΔTMAO、ΔD-乳酸、Z評分、Z評分+hs-CRP+CD14+CD16+單核細胞計數預測老年糖尿病患者發生MACE的AUC分別為0.647、0.630、0.681、0.822，提示與ΔTMAO、ΔD-乳酸、Z評分單獨預測相比，Z評分+hs-CRP+CD14+CD16+單核細胞計數預測老年糖尿病患者發生MACE的價值較高，腸道菌群易位進入全身循環可能是誘導老年糖尿病患者發生MACE的主要原因之一。

本研究結果顯示，ΔTMAO與老年糖尿病患者ΔCD14+CD16+單核細胞計數呈正相關，ΔTMAO和ΔD-乳酸與MACE（+）組患者ΔCD14+CD16+單核細胞計數呈正相關。推測腸道菌群代謝產物在體循環中的積累會觸發單核細胞的募集，從而激活全身炎癥反應并最終導致心臟損傷［12］。研究表明，采用TMAO等腸道菌群代謝產物刺激單核細胞亞群可產生促炎細胞因子TNF-α，進而調節免疫反應［13］。這種腸道菌群的驅動作用也得到了既往研究的支持，即腸道菌群可以通過調節造血功能而直接影響先天免疫細胞的發育［14］。有證據表明，人骨髓含有CD14+CD16+單核細胞庫［15］，表明MACE發生后血液循環中的CD14+CD16+單核細胞可能直接從骨髓或脾臟庫中調動。

綜上所述，發生MACE的老年糖尿病患者全身微生物組多樣性增加，腸道菌群易位是老年糖尿病患者發生MACE的影響因素；且與ΔTMAO、ΔD-乳酸、Z評分單獨預測相比，Z評分+hs-CRP+CD14+CD16+單核細胞計數預測老年糖尿病患者發生MACE的價值較高。但本研究樣本量有限，可能影響結果的可信度。未來仍需通過前瞻性、大樣本量研究進一步驗證本研究結果。

作者貢獻：陸水英進行文章的構思與設計，結果分析與解釋，負責撰寫、修訂論文；劉琳進行研究的實施與可行性分析；陳力行進行數據收集、整理、分析；湯之明負責文章的質量控制及審校，并對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。