機械化學(xué)法制備亞穩(wěn)態(tài)7-羥基異黃酮溶劑合物多晶型*

劉梅菊,謝逸菲,鄒瑤,喻紅梅,周健,龔寧波,呂揚

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所1.晶型藥物研究北京市重點實驗室;2.國家藥物篩選中心,北京 100050)

黃酮類化合物在自然界廣泛存在[1],根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)可將其分為黃酮和黃酮醇、異黃酮、異黃烷酮、查耳酮、二氫查耳酮、黃烷和黃烷醇、黃烷二醇等十幾個類別[2],該類化合物具有抗氧化[3-4]、降糖[5-7]、抗腫瘤[8]、抗菌[9]、免疫調(diào)節(jié)[10]等多種生物活性,已成為國內(nèi)外醫(yī)藥保健行業(yè)研究熱點。異黃酮主要存在于豆科植物和中草藥中[11],主要的膳食異黃酮是染料木素和大豆異黃酮[12]。7-羥基異黃酮是大豆異黃酮的代謝產(chǎn)物[13],分子式為C15H10O3,結(jié)構(gòu)式見圖1。7-羥基異黃酮應(yīng)用十分廣泛,可作為重要的藥物中間體[14],用于合成治療骨質(zhì)疏松[15]、防止腫瘤細(xì)胞擴散、治療冠心病等的多種相關(guān)藥物[16],近年來研究發(fā)現(xiàn)其還具有光保護(hù)[17]、抗腫瘤[13]、抗病毒[18]等活性。

7-羥基異黃酮存在多晶型現(xiàn)象,本課題組前期研究獲得晶型7種[19],其中包括非溶劑晶型2種(晶1型和晶2型)和溶劑合物5種(二甲亞砜合物、N,N-二甲基甲酰胺合物、正丙醇合物、正丁醇合物和叔丁醇合物)。晶1型和5種溶劑合物均為亞穩(wěn)定晶型,在環(huán)境條件下會逐漸轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定晶型晶2型。在對7-羥基異黃酮進(jìn)行共晶研究、7-羥基異黃酮作為中間體或終端藥物生產(chǎn)的過程中,不可避免地會使用到各種溶劑,存在產(chǎn)生溶劑合物晶型雜質(zhì)的風(fēng)險。因此,對7-羥基異黃酮溶劑合物的多晶型現(xiàn)象進(jìn)行全面系統(tǒng)的研究,對于保證藥品安全性、有效性具有重要意義。

圖1 7-羥基異黃酮化學(xué)結(jié)構(gòu)

筆者在本實驗采用機械化學(xué)法,制備獲得2種新的7-羥基異黃酮溶劑合物,分別為異戊醇合物和正辛醇合物,采用單晶X射線衍射分析(single crystal X-ray diffraction,SXRD)、粉末X射線衍射分析(powder X-ray diffraction,PXRD)、差示掃描量熱分析(differential scanning calorimeter,DSC)、熱重分析(thermo gravimetric analysis,TGA)和傅里葉變換紅外光譜技術(shù)(fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)等現(xiàn)代分析技術(shù)分別對2種新晶型進(jìn)行表征,并考察其穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 7-羥基異黃酮(嘉興君康工貿(mào)有限公司,批號:20070723,晶2型)、異戊醇(天津市福晨化學(xué)試劑廠,批號:20210801)、正辛醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠,批號:20201211)。實驗所用溶劑均為分析純。

1.1.2儀器 單晶X射線衍射儀:Rigaku MicroMax 002+單晶衍射儀,美國理學(xué)Rigaku公司;粉末X射線衍射儀:Rigaku D/max-2550粉末X射線衍射儀,日本理學(xué)Rigaku公司;差示掃描量熱儀:DSC1型,瑞士Mettler Toledo公司;熱重分析儀:TGA/DSC1型,瑞士Mettler Toledo公司;紅外光譜儀:Spectrum 400型,美國PerkinElmer公司。

1.2方法

1.2.1溶劑合物的制備 7-羥基異黃酮-異戊醇:稱取7-羥基異黃酮60 mg,置瑪瑙研缽,加入異戊醇0.2 mL,研磨5 min,可得到異戊醇合物;7-羥基異黃酮-正辛醇:稱取7-羥基異黃酮60 mg,置瑪瑙研缽,加入正辛醇0.1 mL,研磨10 min,可得到正辛醇合物;晶體生長:分別取7-羥基異黃酮-異戊醇合物和7-羥基異黃酮-正辛醇合物粉末各20 mg,分別溶于適量異戊醇和正辛醇溶劑,濾過,續(xù)濾液靜置,20～30 d獲得適用晶體。

1.2.2SXRD 采用單晶X射線衍射儀,CuKα輻射,共聚焦單色器,準(zhǔn)直光管直徑(ф)=0.30 mm,晶體CCD探測器距離d=45 mm,管壓45 kV,管流0.88 mA,ω與κ掃描方式。SHELXT(Sheldrick,2018)直接法解析晶體結(jié)構(gòu),最小二乘法進(jìn)行結(jié)構(gòu)參數(shù)校正,計算獲得溶劑合物的單晶結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。

1.2.3PXRD 采用粉末X射線衍射儀,CuKα輻射,石墨單色器,管壓40 kV,管流150 mA,2θ掃描范圍3～80°,掃描速度8°·min-1,步長0.02°,發(fā)散狹縫DS=1°,接收狹縫RS=0.15 mm,散射狹縫SS=1°,數(shù)據(jù)使用MDI JADE軟件(Version 6.5)進(jìn)一步處理。使用Mercury軟件(Version 4.3.1,英國劍橋晶體數(shù)據(jù)庫)計算獲得溶劑合物的理論PXRD圖譜。

1.2.4DSC 采用差示掃描量熱儀,范圍30～250 ℃,升溫速率10 ℃·min-1,使用標(biāo)準(zhǔn)鋁坩堝,精密稱取樣品2～4 mg,檢測。使用STAR軟件包對譜圖進(jìn)行記錄及分析處理。

1.2.5TG 采用熱重分析儀,將樣品約8 mg置于氧化鋁坩堝,溫度30～500 ℃,升溫速率5 ℃·min-1,以氮氣作為保護(hù)氣,氣體流速50 mL·min-1。使用STAR軟件包對譜圖進(jìn)行記錄及分析處理。

1.2.6FT-IR 采用傅里葉變換紅外光譜儀,衰減全反射法,光譜掃描范圍4000～450 cm-1,儀器分辨率4.0 cm-1。使用SPECTRUM軟件包對譜圖進(jìn)行記錄及分析處理。

1.2.7穩(wěn)定性考察方法 將樣品置于常溫[(20±2)℃]、高溫[(60±2)℃]2種實驗條件下,于第0,5,10天分別取樣通過PXRD評估樣品穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1SXRD 通過分析前期獲得的7種晶型的結(jié)構(gòu)特點發(fā)現(xiàn),5種溶劑合物都結(jié)晶于單斜晶系,P21/c或P21/n空間群,溶劑分子均參與到分子的結(jié)構(gòu)組成,其中醇性溶劑作為重要的紐帶,穩(wěn)定分子的穩(wěn)定排列,由此推導(dǎo)其他類型的醇性溶劑也可以參與到7-羥基異黃酮的多晶型分子結(jié)構(gòu)中。

進(jìn)一步分析結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),7-羥基異黃酮-異戊醇合物屬于單斜晶系,P21/c空間群,不對稱單元中包含1個7-羥基異黃酮分子和1個異戊醇分子,與已報道的5種溶劑合物的晶體結(jié)構(gòu)相似,但晶胞參數(shù)存在顯著差異。7-羥基異黃酮-正辛醇合物屬于單斜晶系,P21空間群,不對稱單元中包含4個7-羥基異黃酮分子和4個溶劑分子,與其他6種溶劑合物的晶體結(jié)構(gòu)差異較大。2種7-羥基異黃酮溶劑合物的單晶結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)見表1,構(gòu)象疊合圖見圖2(黃色:異戊醇合物;紅色:正辛醇合物),2種溶劑合物主體分子的構(gòu)象基本一致。

表1 2種7-羥基異黃酮溶劑合物的晶體學(xué)數(shù)據(jù)

圖2 2種7-羥基異黃酮溶劑合物的構(gòu)象疊合圖

2種溶劑合物中都含有兩類O-H…O氫鍵,一類為7-羥基異黃酮分子中的-OH(氫鍵供體)和溶劑分子中-OH的O原子(氫鍵受體)存在的氫鍵聯(lián)系(O3-H3…O4),另一類為7-羥基異黃酮分子中羰基的O原子(氫鍵受體)和溶劑分子中的-OH(氫鍵供體)存在的氫鍵聯(lián)系(O4-H4…O2)。氫鍵是連接7-羥基異黃酮分子和溶劑分子的關(guān)鍵因素,7-羥基異黃酮分子中的羥基和羰基基團為分子間氫鍵的形成提供了可能,由此可進(jìn)一步探索更多7-羥基異黃酮的新晶型和共晶物。2種7-羥基異黃酮溶劑合物中的氫鍵參數(shù)見表2。

表2 2種7-羥基異黃酮溶劑合物中的氫鍵參數(shù)

2種7-羥基異黃酮溶劑合物的分子堆積圖見圖3。在異戊醇合物中,異戊醇同時作為氫鍵供體和受體將7-羥基異黃酮分子和溶劑分子連接起來,形成一條沿著c軸的Z型鏈狀結(jié)構(gòu),與已報道的正丙醇合物和正丁醇合物結(jié)構(gòu)類似。在正辛醇合物中,正辛醇也同時作為氫鍵供體和受體將7-羥基異黃酮分子和溶劑分子連接起來,以4分子的7-羥基異黃酮和溶劑為結(jié)構(gòu)基元,沿著a軸方向形成帶狀結(jié)構(gòu)。

圖3 2種7-羥基異黃酮溶劑合物的分子堆積圖

2.2PXRD 根據(jù)SXRD數(shù)據(jù),使用Mercury軟件計算獲得2種7-羥基異黃酮溶劑合物的理論PXRD圖譜,2種7-羥基異黃酮溶劑合物的理論與實驗PXRD圖譜見圖4。2種晶型衍射峰的數(shù)量、位置、強度和峰形幾何拓?fù)渚休^明顯差異,其PXRD圖譜具有指紋性,可實現(xiàn)2種晶型物質(zhì)的有效鑒別。異戊醇合物的指紋性表現(xiàn)為其較強的特征衍射峰(以2θ表示),分別為4.62°,14.44°,15.16°,17.08°,18.88°,21.96°,22.38°,23.40°,25.04°,25.48°,25.90°,28.92°。正辛醇合物的指紋性表現(xiàn)為其較強的特征衍射峰(以2θ表示),分別為3.74°,14.30°,16.70°,22.72°,23.94°,26.42°。其理論PXRD圖譜還可作為晶型識別與質(zhì)量控制的對照圖譜使用,為7-羥基異黃酮藥物中多晶型“雜質(zhì)成分”的質(zhì)量控制提供了標(biāo)準(zhǔn)與科學(xué)數(shù)據(jù)。實驗PXRD圖譜中衍射峰的數(shù)量、位置和強度與理論PXRD圖譜均一致,足以證明采用機械化學(xué)法成功制備得到了7-羥基異黃酮-異戊醇合物和7-羥基異黃酮-正辛醇合物,且該樣品可用于2種新晶型的進(jìn)一步表征研究。

圖4 2種7-羥基異黃酮溶劑合物的理論及實驗PXRD圖譜

2.3DSC 2種7-羥基異黃酮溶劑合物的DSC圖譜見圖5,DSC吸熱峰數(shù)據(jù)見表3。異戊醇合物和正辛醇合物的DSC曲線與已報道的正丙醇合物、正丁醇合物以及叔丁醇合物相似,均在7-羥基異黃酮熔融吸熱峰前出現(xiàn)失去溶劑的吸熱峰,但該吸熱峰的數(shù)量、位置不盡相同,這不僅與溶劑本身沸點有關(guān),也反映溶劑與7-羥基異黃酮之間相互作用力的大小[20]。2種7-羥基異黃酮溶劑合物的DSC圖譜各不相同,表明DSC技術(shù)可實現(xiàn)2種晶型物質(zhì)有效鑒別[21]。

2.4TG TG法是在程序控溫的條件下,測定物質(zhì)的質(zhì)量隨溫度變化的一種分析技術(shù)[22],可用來測定溶劑合物中所含溶劑的化學(xué)計量數(shù)[23]。2種7-羥基異黃酮溶劑合物的TG圖譜見圖6。異戊醇合物和正辛醇合物的TG圖譜都有2個失重臺階,第1個失重臺階由溶劑損失導(dǎo)致,失重百分比分別為26.0%,39.3%,以此計算出7-羥基異黃酮與異戊醇和正辛醇的化學(xué)計量比分別為1：0.95,1：1.18,與通過晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)得到的1：1化學(xué)計量比大致吻合;第2個失重臺階由7-羥基異黃酮熔融分解導(dǎo)致。

2.5FT-IR 7-羥基異黃酮原料及2種溶劑合物的IR圖譜見圖7。由于溶劑的介入,分子間作用力發(fā)生改變,導(dǎo)致IR圖譜出現(xiàn)峰形、峰位、峰強的差異[24]。相較于7-羥基異黃酮原料,在異戊醇合物和正辛醇合物的IR圖譜中,由于分子間氫鍵的形成,1621 cm-1處的C=O伸縮振動峰吸收強度稍有增強;3248 cm-1處的O-H伸縮振動峰吸收強度稍有減弱,異戊醇合物在此處的峰分裂成2個峰。

2.6穩(wěn)定性研究 異戊醇合物和正辛醇合物均為亞穩(wěn)定晶型,在常溫條件[(20±2) ℃]和高溫條件[(60±2) ℃]下會逐漸轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定晶型晶2型,與已報道的5種溶劑合物結(jié)果相同。

3 討論

筆者在本研究采用機械化學(xué)法,成功獲得2種7-羥基異黃酮新晶型,分別為7-羥基異黃酮-異戊醇合物(1：1)和7-羥基異黃酮-正辛醇合物(1：1)。采用SXRD、PXRD、DSC、TG、FT-IR等不同分析技術(shù)對其進(jìn)行了表征研究,報道了2種溶劑合物的晶體結(jié)構(gòu),其PXRD圖譜具有指紋性,DSC圖譜有明顯差異,可實現(xiàn)2種晶型物質(zhì)的有效鑒別。對2種溶劑合物進(jìn)行了穩(wěn)定性研究,發(fā)現(xiàn)其均為亞穩(wěn)定晶型,可轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定晶型晶2型。

圖5 2種7-羥基異黃酮溶劑合物的DSC圖譜

表3 2種7-羥基異黃酮溶劑合物的DSC吸熱峰數(shù)據(jù)

圖6 2種7-羥基異黃酮溶劑合物的TG曲線

圖7 7-羥基異黃酮原料及其溶劑合物的IR圖譜

本研究結(jié)果提示,7-羥基異黃酮易于形成溶劑合物,除了已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的7種溶劑合物外,在使用其他醇類有機溶劑時,還存在形成其他亞穩(wěn)態(tài)7-羥基異黃酮溶劑合物的可能,在制備和生產(chǎn)過程中應(yīng)注意避免7-羥基異黃酮溶劑合物雜質(zhì)的產(chǎn)生,并應(yīng)對其進(jìn)行嚴(yán)格的晶型質(zhì)量控制,以保證藥品的安全性和有效性[20,25]。