基于超高效液相色譜與紅外光譜的金銀花藥材產地溯源*

李籽杉,杜澤飛,楊曉,丁豐,夏從龍,周萍,段寶忠

(1.大理大學藥學院,大理 671000;2.云南省北花農業發展有限公司,云龍 672700)

金銀花為傳統中藥,來源于忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花[1],具清熱解毒、疏風散熱之功效,主要用于熱毒血痢、風熱感冒、咽喉腫痛等[2-3]。以其作為原料生產的成藥有金銀花露、銀翹解毒片和雙黃連口服液等,素有“中藥青霉素”之稱[4]。金銀花含有酚酸類、黃酮類及萜類等多種成分[5-7],具有抗氧化、抗炎、抗菌及降血糖等藥理活性[8-10]。金銀花在我國種植廣泛,其中河南封丘、山東平邑和河北巨鹿為金銀花傳統道地產區[11]。近年來隨著市場需求不斷增大,金銀花栽培面積和種植地區日益擴大,在云南、甘肅等地有大量引種栽培。研究表明,藥材質量受氣候環境、海拔高度、采收期或種質等的影響,不同產區金銀花樣品化學成分等存在差異[12-16]。由于不同產區金銀花加工后外形相似,僅憑肉眼難以區分,市場上以次充好、品種混淆等問題普遍存在[17],影響了金銀花臨床應用的有效性和安全性。因此,建立快速、準確的產地溯源方法,有助于實現金銀花樣品產地的快速識別,對保證金銀花臨床療效和維護市場健康發展具有重要意義。

藥用植物的產地溯源方法主要有紅外光譜、分子標記以及穩定同位素、礦物元素、色譜指紋圖譜等手段[18],其中紅外光譜具有操作簡單、分析快速、樣品無耗損等特點[19],可間接反映樣品中化學組成信息,在臨床藥物篩選、糧食作物和中藥材的產地溯源以及質量控制等領域廣泛應用[20-22]。色譜指紋圖譜可從整體上表征復雜成分的特征性和相似性,已在蘆薈[23]、草果[24]、玉竹[25]等中藥材的質量評價領域廣泛應用。目前,已有采用傅里葉變換紅外光譜(fourier transform infrared,FTIR)對山東、河北、四川等產地,以及超高效液相色譜(ultra-high performance liquid chromatography,UPLC)指紋圖譜對山東和河南產地金銀花樣品質量的評價研究[26-27],但筆者尚未見采用化學計量學方法探討金銀花產地溯源體系構建的相關研究,尤其是道地產區山東與新產區云南的差異未見報道。鑒于此,筆者在本研究采用FTIR和UPLC指紋圖譜技術,結合主成分分析(principal component analysis,PCA)和聚類分析(hierachical cluster analysis,HCA)方法,對山東和云南產區金銀花樣品進行研究,以期為建立金銀花樣品產地溯源和資源合理開發利用提供依據。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1290型超高效液相色譜儀(二元梯度泵、DAD檢測器)(美國 Agilent 公司),Nexus FTIR儀(Thermo Nicolet 380),AL204電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司,感量:0.1 mg],FY135型中草藥粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司),SB25-12D超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司),HW-3紅外烘干箱(天津市光學儀器廠),FW-4A型粉末壓片機(天津市拓普儀器有限公司),瑪瑙研缽。

1.2試藥 綠原酸(批號:MUST-12031401)和木犀草苷(批號:MUST-17121210)對照品購自成都曼思特生物科技有限公司,含量均≥98%。光譜級溴化鉀單晶粉末(天津天光光學儀器有限公司,批號:170421),色譜級乙腈(Fisher Scientific,批號:085884),磷酸溶液,甲醇,其他試劑均為分析純,水為超純水。

40批金銀花樣品(表1),采集于云南省和山東省,經大理大學段寶忠教授鑒定為忍冬科植物忍冬L.japonicaThunb.的干燥花蕾,憑證標本保存于大理大學中藥標本館。

2 UPLC指紋圖譜

2.1色譜條件 色譜柱Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動相為乙腈(A)和0.1%磷酸溶液(B),梯度洗脫程序:0～5 min,12%→15% A;5～10 min,15%→24%A;10～15 min,24%→33%A;柱溫35 ℃;檢測波長350 nm;流速0.2 mL·min-1,進樣量2 μL。在上述條件下,木犀草苷和綠原酸分離良好。

表1 金銀花樣品信息

2.2對照品溶液的制備 取綠原酸與木犀草苷對照品適量,精密稱定,加甲醇制成綠原酸和木犀草苷濃度約為0.2 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3供試品溶液的制備 將不同品種金銀花樣品置于60 ℃干燥至恒重,粉碎過80目篩(篩孔內徑0.178 mm),備用。分別取0.2 g,精密稱定,置100 mL具塞錐形瓶,加入50%甲醇50 mL,稱定質量,室溫超聲40 min,超聲結束后加50%甲醇補足失重,搖勻,上清液過孔徑0.45 μm濾膜,取續濾液,即得。

2.4精密度實驗 取同一金銀花供試品溶液(批號:S1),按“2.1”項色譜條件連續進樣6次,記錄色譜圖,并對各共有峰保留時間和峰面積進行考察,計算得各共有峰保留時間的RSD為0.04%～0.62%,峰面積RSD為0.49%～1.61%,表明儀器精密度良好。

2.5重復性實驗 取同一金銀花樣品(批號:S1)粉末0.2 g,精密稱定6份,按“2.3”項方法制備供試品溶液,按“2.1”項色譜條件依次進樣測定,記錄色譜圖,并對各共有峰保留時間和峰面積進行考察,計算得到各共有峰保留時間的RSD為0.04%～1.20%,峰面積RSD為0.50%～3.04%,表明該方法重復性良好。

2.6穩定性實驗 取同一金銀花供試品溶液(批號:S1),按“2.1”項色譜條件分別在0,2,4,8,12,24 h進樣測定,記錄色譜圖,各共有峰保留時間RSD為0.04%～1.58%,峰面積RSD為0.69%～2.98%,提示供試品溶液24 h內基本穩定。

2.7線性關系考察 取“2.2”項綠原酸與木犀草苷混合對照品溶液,等比稀釋成一系列濃度混合對照品溶液,按“2.1”項色譜條件測定峰面積。以色譜峰面積(Y)對進樣濃度(X,μg·mL-1)進行線性回歸,得回歸方程分別為:綠原酸Y=1 176.9X-12.121(r=0.999 2),線性范圍為0.023 0～0.230 mg·mL-1;木犀草苷Y=4 676.1X+75.601(r=0.999 2),線性范圍為0.023 6～0.236 mg·mL-1。

2.8加樣回收率實驗 精密稱取已知含量金銀花樣品(批號:S1)粉末,平行6份,分別精密加入一定量混合對照品溶液,按“2.3”項制備供試品溶液,在“2.1”項色譜條件進樣,計算得綠原酸、木犀草苷加樣回收率分別為99.60%,99.64%,RSD分別為0.71%,4.09%。

2.9樣品含量及指紋圖譜相似度分析 將40批金銀花樣品,按“2.3”項方法制備供試品溶液,進樣記錄各樣品15 min色譜圖,采用指紋圖譜軟件處理,共獲得共有峰12個,通過對照品保留時間確認3號峰為綠原酸,8號峰為木犀草苷,色譜圖見圖1;各樣品中綠原酸、木犀草苷含量及樣品相似度計算結果見表2。含量分析顯示,在40批金銀花樣品中,有5批樣品(S18、S20、S21、S22、S29)綠原酸含量低于1.5%(表2),其中除S29以外,其余均為8月采收的“九豐一號”樣品。之前的研究顯示,“九豐一號”和“濟草堂一號”兩個金銀花花蕾中的綠原酸和木犀草苷含量從5月到9月逐漸減少[28]。從木犀草苷含量看,不同月份采收的金銀花樣品有一定差異,在40批樣品中,除S10和S22號樣品外,僅7月采收的九豐一號(S12～S16)樣品木犀草苷含量高于0.050%。綜合2種指標成分含量測定結果,提示7月云南產區的“九豐一號”金銀花有效成分積累達到最高,可能由于7月是云南產區雨季,且溫度較高,此時具備金銀花植物生長的最適氣候。此外,相似度計算結果顯示,40批樣品與對照圖譜的相似度均>0.90,表明不同產地及不同品種金銀花樣品色譜峰總體穩定。值得注意的是,雖然本研究提取方法與《中華人民共和國藥典》(2020年版)相同,均為超聲提取,但本研究提取的溶劑為50%甲醇,相比《中華人民共和國藥典》(2020年版)采用75%甲醇,本實驗的提取方法具有更多色譜峰,提供了更多的變量信息以利于產地溯源。然而本研究結果也顯示,若按《中華人民共和國藥典》(2020年版)金銀花中綠原酸和木犀草苷含量的限值規定,本研究中大部分樣品不符合要求,可能原因是提取溶劑影響了上述兩種成分的提取效率,導致兩種成分總量較低。在之前的研究中,李春燕等[29]發現在提取綠原酸時,醇提優于水提,可能原因是綠原酸含有羥基和鄰二酚基,極性與醇相對接近,一定程度上解釋了本研究的大部分樣品兩種成分的含量低于《中華人民共和國藥典》(2020年版)規定限值的原因,這也是本研究的局限之一,有待進一步實驗驗證。

3.綠原酸;8.木犀草苷。

2.10系統聚類分析 將40批金銀花樣品共有峰相對于參比峰進行峰面積量化,得到40 × 12階數據矩陣,采用SPSS 20.0版軟件作聚類分析,選用Ward's法和歐氏距離法進行聚類分析,結果見圖2。40批金銀花樣品可分為兩大類,來自山東的樣品S23～S30樣品單獨聚為一類;來自云南的樣品聚為一類,云南產區不同品種無法實現有效區分;提示金銀花藥材質量受產地影響較大,而受品種影響相對較小。

2.11主成分分析 將40批金銀花樣品進行PCA分析,結果顯示前兩個主成分累積方差貢獻率>90.60%,PCA得分圖(圖3)顯示,40批樣品分成2類,來自山東的金銀花樣品S23～S30單獨聚為一類,產于云南的九豐一號S1～S22以及北花一號樣品S31～S40聚為一類,PCA結果與HCA結果基本一致,表明基于PCA方法可實現不同產區金銀花樣品的識別,但無法區分同一產區的不同品種金銀花。

3 紅外光譜

3.1供試品的制備 取金銀花樣品粉末1.0 mg至瑪瑙研缽中,加入溴化鉀粉末200.0 mg作為分散劑,研磨均勻,取適量細粉平鋪于模具中,并以20 MPa壓強壓制1 min,取出,對光檢視,得到色澤均勻的透明錠片,備用。

3.2紅外光譜條件 光譜掃描范圍4000～400 cm-1,掃描32次,分辨率4 cm-1,掃描時實時扣除水(H2O)和二氧化碳(CO2)背景。

3.3數據分析 采用OMNIC 8.0版軟件對光譜數據進行坐標歸一化、基線校正、平滑(點數15)處理。HCA分析使用SPSS 20.0版軟件,PCA分析使用SIMCA 13.0版軟件,二階導數采用Origin 8.5版軟件計算后繪制曲線。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2004 A版)進行相似度分析,參數設置為中位數法,時間窗寬度為0.1 min,自動匹配生成對照圖譜。

3.4精密度實驗 以同一金銀花樣品(批號:S1)為考察對象,按“3.2”項方法,連續重復掃描5次,所得紅外圖譜的相關系數在0.999 1～0.999 9,RSD為0.03%,表明精密度良好。

3.5重復性實驗 取同一金銀花供試品(批號:S1)5份,按“3.1”項方法分別壓片,所得紅外圖譜的相關系數在0.998 8～0.999 6,RSD為0.06%,表明重復性良好。

3.6穩定性實驗 取同一金銀花供試品(批號:S1),分別在0,0.5,1,2,3,4,5 h,按“3.1”項方法進行測定,所得紅外圖譜的相關系數在0.980 8～0.998 6,RSD為0.7%,表明錠片在5 h內穩定性良好。

3.7金銀花紅外光譜比較分析 不同產地金銀花平均紅外光譜見圖4,從圖中可見,不同產地、不同品種及不同采收期金銀花樣品峰形、峰位基本一致,而強度有一定差異,表明所研究的金銀花樣品所含組分基本相同,積累量有一定差異。從樣品平均IR圖譜看,2800～3500 cm-1附近可能為烷基C-H對稱伸縮振動和O-H伸縮振動吸收峰[30];1800～1500 cm-1處可能為酰胺Ⅰ帶和Ⅱ帶的特征C=O伸縮振動,以及苯環的特征吸收[31];1200～1000 cm-1處為多糖、皂苷等物質的混合振動吸收區[32]。上述特征峰與金銀花樣品中黃酮類、酚酸類等物質的結構吻合。

3.8紅外光譜二階導數比較分析 為更好地顯示紅外光譜圖譜疊合蔽峰,本研究采用二階導數處理后對金銀花樣品間差異進行了比較。在之前的研究中,鄒婧等[33]采用紅外光譜對金銀花樣品進行溯源研究,發現來自5個產地的金銀花樣品可明顯區分,僅云南產地的樣品二階導數在3668 cm-1處有吸收峰,但該項研究用于建模的樣品數量僅有1份,存在一定的局限性。本研究中,同一產地使用了多份樣本重復,有效避免了由于偶然因素導致的誤差。從二階導數譜圖(圖5)可見,九豐一號在3000～2750 cm-1波段范圍內,在2857和2921 cm-1處有吸收峰,而在北花一號樣品中,無類似的“鋸齒”吸收峰,據此可將兩個品種進行區分。云南產九豐一號均在3250 cm-1附近有吸收峰,而山東產九豐一號中未發現3250 cm-1吸收峰,可將不同產區金銀花樣品區分。

表2 金銀花指標成分含量測定及指紋圖譜相似度評價結果

圖2 金銀花樣品的UPLC聚類分析圖(n=40)

圖3 金銀花樣品UPLC主成分分析(n=40)

3.9層次聚類分析 將40批樣品原始譜圖進行二階求導預處理,使用Ward's法和歐氏距離進行HCA分析,結果見圖6。從圖6可知,當判別距離為20時,樣本被分為兩類:第一類包括10批云南產北花一號(S31～S40);第二類包括30批九豐一號金銀花樣品,分別為8批山東產區(S23～S30)和22批云南產區(S1～S22);上述結果表明從IR二階導數光譜數據來看,金銀花樣品品種對化學成分的影響大于產地。在判別條件距離為10時,8批山東產九豐一號、22批云南產九豐一號和10批云南產北花一號各自聚為一支,可明顯區分,上述結果提示FTIR二階導數光譜可用于不同品種和不同產地的金銀花品種及產地溯源。

圖4 不同品種、產地、采收期金銀花紅外光譜圖

3.10主成分分析 PCA是一種無監督多變量數據分析法,其在不損失主要信息的前提下實現降維,擴大樣本之間的差異,可解決由于中藥成分復雜所致的譜帶重疊分析困難[34]。將40批金銀花樣品紅外光譜經自動基線校正+自動平滑+縱坐標歸一化+二階求導預處理后的數據,進行PCA分析,從PCA得分圖(圖7)可看出樣品被分為3類,與HCA結果一致。

4 討論

筆者在本研究中采用FTIR和UPLC結合化學計量學方法,對40批來自不同產地的金銀花藥材進行研究。結果表明,基于UPLC色譜可實現不同產區金銀花產地溯源,但無法識別同一產區不同品種的樣品,而FTIR光譜可實現金銀花品種和產地溯源。鑒于不同產區或不同品種金銀花在外形上的相似性,傳統性狀、顯微和理化鑒定方法存在一定局限性,金銀花樣品的混用對臨床用藥造成了一定的安全隱患。紅外光譜為多組分特征信息監測,對固態樣品僅需研磨等簡單預處理,可實現無損檢測[35]。UPLC方法同時可實現有效成分含量的檢測,結合多元統計方法可對樣品的多元特征信息進行提取和分析,易培訓和推廣,為準確判別金銀花的地理來源提供了一種新的客觀快速的方法,有望應用于市場監督領域,本研究為新方法的構建提供了參考。

A.云南產九豐一號(5月);B.云南產九豐一號(6月);C.山東產九豐一號(5月);D.云南產九豐一號(7月);E.云南產北花一號(5月);F.云南產九豐一號(8月)。

圖6 不同品種和不同產地金銀花紅外光譜聚類分析圖(n=40)

圖7 不同品種和不同產地金銀花紅外光譜主成分分析圖(n=40)