基于網絡藥理學探討益氣補肺顆粒對肺癌的免疫調節機制

戴菲菲 孔紅武 謝柏勝

[摘要]?目的?利用網絡藥理學方法探討益氣補肺顆粒對肺癌的免疫調節機制。方法?應用中藥系統藥理學數據庫分析平臺（traditional?Chinese?medicine?systems?pharmacology?database?and?analysis?platform，TCMSP）、公共化合物數據庫（PubChem）、藥物靶點預測數據庫（Swiss?Target?Prediction）及人類基因數據庫（the?Human?Gene?Database，GenCards）分別獲得藥物成分、藥物潛在靶點和肺癌相關靶點，將二者交集靶點通過String數據平臺進行藥物–疾病蛋白質互作網絡構建，進而利用Cytoscape軟件篩選出關鍵藥物成分和核心靶點。通過Webgestalt數據平臺進行基因本體（gene?ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes，KEGG）信號通路富集分析；運用AutoDock進行分子對接。結果?益氣補肺顆粒含有潛在活性成分129個，主要成分包括3-甲氧基光甘草定、甘草酚、菜豆醇、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、豆甾醇。調節肺癌相關免疫功能的潛在靶點137個，核心靶點主要有信號轉導及轉錄激活蛋白3（signal?transduction?and?activator?of?transcription?3，STAT3）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（rac-alpha?serine/?threonine-protein?kinase，AKT1）、酪氨酸蛋白激酶（tyrosine?protein?kinase，TPK）、絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated?protein?kinase3，MAPK3）、熱休克蛋白90α家族A類成員1[heat?shock?protein?90-kDa?alpha（cytosolic），class?A?member?1，HSP90AA1]。GO富集分析結果顯示核心靶點主要與炎癥反應、免疫系統調節、蛋白質磷酸化等有關；KEGG信號通路主要包括C型凝集素受體（c-type?lectin?receptor，CLR）信號通路、血管內皮生長因子（vascular?endothelial?growth?factor，VEGF）信號通路、Th17細胞分化等。分子對接結果顯示5個關鍵成分與5個核心靶點均有較好的結合活性。結論?益氣補肺顆粒可通過甘草、天冬、當歸、人參中的多種活性成分、多靶點作用，并通過影響CLR信號通路、VEGF信號通路、Th17細胞分化等多通路起到提高肺癌患者免疫功能的作用。

[關鍵詞]?肺癌；免疫功能；益氣補肺顆粒；網絡藥理學；分子對接

[中圖分類號]?R285??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.15.014

Study?on?the?immunomodulatory?mechanism?of?Yiqi?Bufei?granule?on?lung?cancer?based?on?network?pharmacology

DAI?Feifei，?KONG?Hongwu，?XIE?Baisheng

Department?of?Cardiothoracic?Surgery，?Hangzhou?Hospital?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Hangzhou?310007，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?explore?the?mechanism?of?Yiqi?Bufei?granule?in?regulating?immune?function?of?lung?cancer?by?network?pharmacology.?Methods?Traditional?Chinese?medicine?systems?pharmacology?database?and?analysis?platform?（TCMSP），?PubChem，?Swiss?Target?Prediction?and?the?human?gene?database?（GenCards）?were?used?to?obtain?drug?components，?potential?drug?targets?and?lung?cancer?related?targets，?respectively.?The?intersection?targets?of?the?two?were?used?to?construct?drug-disease?protein?interaction?network?through?String?data?platform.?CytoScape?software?was?used?to?screen?out?key?drug?components?and?core?targets.?Gene?ontology（GO）?enrichment?analysis?and?Kyoto?Eencyclopedia?of?Genes?and?Genomes?（KEGG）?pathway?analysis?were?analyzed?by?Webgestalt?data?platform.?Molecular?docking?was?performed?using?AutoDock.?Results?Yiqi?Bufei?granule?contained?129?potential?active?ingredients，?included?3-methoxy-glabridin，?glycyrol，?phaseol，?7-methoxy-2-methyl?isoflavone，?and?stigmasterol.?There?were?137?potential?targets?for?regulating?lung?cancer-related?immune?function，?and?the?core?targets?mainly?included?signal?transduction?and?activator?of?transcription?3?（STAT3），?proteinkinase?（AKT1），?tyrosine?protein?kinase（TPK），?mitogen-activated?protein?kinase3?（MAPK3）?and?heat?shock?protein?90-kDa?alpha?（cytosolic），?class?A?member?1?（HSP90AA1）.?GO?enrichment?analysis?showed?that?the?core?targets?were?mainly?related?to?inflammatory?response，?immune?system?regulation，?protein?phosphorylation，?etc.?KEGG?pathway?mainly?included?c-type?lectin?receptor?（CLR）?signaling?pathway，?vascular?endothelial?growth?factor?（VEGF）?signaling?pathway，?Th17?cell?differentiation?and?so?on.?The?results?of?molecular?docking?showed?that?the?five?key?components?had?good?binding?activities?with?the?five?core?targets.?Conclusion?Yiqi?Bufei?granule?may?have?multiple?active?ingredients?and?targets?in?licorice，?tiandong，?angelica，?ginseng，?and?may?also?improve?the?immune?function?of?lung?cancer?patients?by?affecting?multiple?pathways?such?as?CLR?signaling?pathway，?VEGF?signaling?pathway，?and?Th17?cell?differentiation.

[Key?words]?Lung?cancer;?Immune?function;?Yiqi?Bufei?granule;?Network?pharmacology;?Molecular?docking

肺癌是一種由遺傳和表觀遺傳畸變驅動的疾病，在所有惡性腫瘤中，肺癌發病率和病死率位居前二[1-2]。傳統化療和放療可產生多種不良反應，如器官功能受損、腫瘤細胞轉移、耐藥及相關免疫功能下降[3-4]。中醫認為治療肺癌應祛除邪毒，與現代醫學抑制腫瘤細胞增殖、調控細胞凋亡和轉移的治療策略一致。研究顯示，中醫藥對細胞免疫和體液免疫具有良好的調節作用，對減輕肺癌患者不良反應和提高生存質量有顯著效果[5-6]。中藥成分可通過不同途徑改變機體免疫功能，如槲皮素通過調節細胞間信號，有效控制腫瘤細胞的數量[7]。研究結果表明益氣補肺顆粒對肺癌患者免疫功能有良好的改善作用，國內外研究均證實益氣補肺顆粒中的中藥成分黃芪、當歸、人參、天冬、五味子、甘草對肺癌治療有一定療效[6，8-12]。中藥成分復雜，其藥理作用可通過不同途徑產生免疫調節作用，但目前有關益氣補肺顆粒對肺癌免疫調節機制的研究較少。本研究在先前研究的基礎上，通過網絡藥理學和分子對接探討益氣補肺顆粒對肺癌患者免疫功能的調節機制，確定藥物的有效活性成分、作用靶點和關鍵通路，為臨床試驗及新藥研發提供理論依據。

1??資料與方法

1.1??益氣補肺顆粒有效活性成分及靶點獲取

益氣補肺顆粒由黃芪、當歸、人參、天冬、五味子、甘草組成。利用中藥系統藥理學數據庫分析平臺（traditional?Chinese?medicine?systems?pharmacology?database?and?analysis?platform，TCMSP）對上述6種中藥的活性成分進行篩選，以藥物生物利用度≥30%、類藥性≥0.18為標準。通過公共化合物數據庫（PubChem）收集成分中化合物的結構式，進而利用藥物靶點預測數據庫（Swiss?Target?Prediction）進行靶點預測，獲得藥物有效活性成分對應的靶點，最后刪除重復靶點，得到藥物作用靶點。

1.2??肺癌免疫功能靶點收集

通過人類基因數據庫（the?Human?Gene?Database，GenCards）搜索“lung?cancer”和“immunity”，得到肺癌、免疫功能相關靶點，篩選標準以相關度值（relevance?score）>8倍中位數值。

1.3??益氣補肺顆粒調節肺癌免疫功能作用靶點及網絡構建

將上述益氣補肺顆粒調節肺癌免疫功能的中藥及其有效活性成分、靶點的數據通過Cytoscape軟件，構建藥物–活性成分–靶點網絡，并計算各個中心度值、節點度值，篩選核心活性成分。

1.4??構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡

將益氣補肺顆粒和肺癌的交集靶點導入String數據平臺，蛋白質參數設置為“multiple?proteins”，物種參數設置為“Homo?sapiens”，交互評分最小值設置為0.7，隱藏離散靶點，構建蛋白質–蛋白質相互作用（protein-protein?interaction，PPI）網絡。下載PPI文件并導入Cytoscape軟件進行拓撲參數分析，分析結果包括中心度值、節點度值，用于核心靶點篩選。

1.5??GO富集分析和KEGG通路富集分析

利用Webgestalt數據平臺對益氣補肺顆粒和肺癌交集靶點進行基因本體（gene?ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes，KEGG）信號通路分析，以P<0.05為標準獲得有差異的生物過程、細胞組分、分子功能及信號通路信息。

1.6??分子對接

從TCMSP數據平臺下載核心活性成分的3D結構作為分子對接的配體小分子；使用AutoDock軟件進行分子對接，結果由Open?Babel軟件進行格式轉換，最后通過PyMOL軟件進行可視化處理。

2??結果

2.1??益氣補肺顆粒活性成分及作用靶點

篩選得到158個活性成分，其中黃芪20個、當歸2個、人參22個、天冬9個、五味子13個、甘草92個，去除重復項后得到129個有效活性成分，其中共有活性成分11個。Swiss?Target?Prediction靶點預測分別得到黃芪690個、當歸115個、人參611個、天冬326個、五味子497個、甘草965個，刪除作用靶點中的重復項，最終獲得1239個益氣補肺顆粒活性成分對應的靶點，見表1。

2.2??益氣補肺顆粒-肺癌-免疫功能相關靶點

通過GenCards獲取肺癌基因和免疫功能基因，篩選后獲得肺癌相關基因1319個，免疫功能基因1081個，藥物–疾病–免疫功能交集靶點137個。

2.3??藥物-活性成分-靶點-疾病網絡構建

有效活性成分、作用靶點及對應的藥物數據網絡構建顯示，共有272個節點，包括6個藥物節點、129個化合物節點和137個交集靶點節點，2917條交互作用關系，見表2。節點度值排名前5的活性成分分別為3-甲氧基光甘草定、甘草酚、菜豆醇、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、豆甾醇。

2.4??蛋白質互作網絡構建與分析

利用Cytoscape軟件繪制PPI網絡圖，共有137個節點、1546條互作關系，通過CytoHubba插件計算獲得節點中心度值、節點度值。根據節點度值進行排序，前20為核心網絡，其中前5名分別為信號轉導及轉錄激活蛋白3（signal?transduction?and?activator?of?transcription?3，STAT3）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（rac-alpha?serine/threonine-protein?kinase，AKT1）、酪氨酸蛋白激酶（tyrosine?protein?kinase，TPK）、絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated?protein?kinase3，MAPK3）、熱休克蛋白90α家族A類成員1（heat?shock?protein?90-kDa?alpha（cytosolic），class?A?member?1，HSP90AA1）。

2.5??GO富集分析和KEGG通路富集分析

GO富集分析獲得生物過程1923條、細胞組成103條及分子功能168條。按照校正P<0.01篩選，將排名前20的條目進行氣泡圖繪制。益氣補肺顆粒對肺癌免疫調節的生物過程主要為炎癥反應、激活免疫反應、免疫系統正向調節、對外部刺激反應調節、白細胞活化；細胞成分主要與膜筏、膜微區、受體復合物、質膜外側、囊泡腔、胞質囊泡腔等密切相關；分子功能涉及STAT3、AKT1、TPK、MAPK3、HSP90AA1等。

KEGG富集分析共得到187個信號通路，以P<0.05篩選排名前20的通路繪制富集條形圖，如C型凝集素受體（c-type?lectin?receptor，CLR）信號通路、血管內皮生長因子（vascular?endothelial?growth?factor，VEGF）信號通路、Th17細胞分化、缺氧誘導因子（hypoxia-induciblefactor-1，HIF-1）信號通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol?3?kinase/protein?kinase?B，PI3K/AKT）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated?protein?kinase，MAPK）信號通路等，見圖1。

2.6??分子對接

結合能<–5kal/mol表明蛋白分子與配體小分子有較好的結合能力，本研究篩選5種關鍵成分與5個核心靶點的分子對接見表3。選擇中心度值最高的STAT3、AKT1、TPK、MAPK3、HSP90AA1與5種關鍵活性成分構建的分子對接模式見圖2。

3??討論

本研究結果表明，益氣補肺顆粒對肺癌免疫調節的主要有效活性成分為3-甲氧基光甘草定、甘草酚、菜豆醇、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、豆甾醇，主要存在于甘草、天冬、當歸、人參4味中藥。同時發現潛在靶點137個，通過PPI網絡圖可知STAT3、AKT1、TPK、MAPK3、HSP90AA1是肺癌免疫調節的核心靶點。

益氣補肺顆粒組方中的黃芪、甘草、人參屬補益類中藥，所含多種黃酮類、酚類和查爾酮類可抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，增加機體免疫功能；天冬、當歸所含活性成分具有潤肺止咳、養血補血的作用[9]。全方奏補脾益肺、養陰潤燥、補血活血之效。研究結果發現，益氣補肺顆粒中的活性成分-3-甲氧基光甘草定、甘草酚、菜豆醇、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、豆甾醇在肺癌免疫調節中發揮關鍵作用。3-甲氧基光甘草定、甘草酚屬異黃酮類化合物，是甘草的主要成分，通過增強巨噬細胞的吞噬能力、

抑制腫瘤細胞增殖，促進抗癌先天免疫和適應性免疫反應[13-15]。Lu等[16]發現健脾復方配方中，菜豆醇是主要活性成分之一，可通過調節β-連環蛋白傳導相關基因和蛋白抑制腫瘤細胞的生長和轉移。研究發現，7-甲氧基-2-甲基異黃酮可通過下調白細胞介素-6基因表達水平發揮抗炎和免疫調節作用[17]，與本研究結果類似。豆甾醇可通過調控MAPK3蛋白表達、雌激素信號通路、甲狀腺激素信號通路發揮抗炎作用[18]。

STAT3、AKT1、TPK是肺癌組織的標志物，是肺癌靶向治療的關鍵靶點。本研究分析表明，STAT3、AKT1、TPK、MAPK3、HSP90AA1是調節肺癌免疫功能的關鍵靶點，與前述結果基本一致[19-24]。通過抑制TPK表達可阻斷AKT信號通路，而AKT1是P13K/AKT、PERK/eIF2α信號通路的樞紐，進而誘導肺癌細胞凋亡，抑制肺癌的發展[19-21]。MAPK3是細胞外信號調節激酶（extracellular?signal-regulatedkinase，ERK）家族的一員，參與調節細胞增殖、分化和生長周期[22]。作為一種伴侶蛋白，HSP90AA1敲低可抑制AKT1和ERK激活，從而促進肺癌細胞凋亡，并抑制肺癌細胞增殖[23]。

KEGG分析結果顯示，益氣補肺顆粒主要通過CLR信號通路、VEGF信號通路、Th17細胞分化、HIF-1信號通路、PI3K/AKT信號通路、MAPK信號通路發揮免疫調節作用。其中CLR信號通路腫瘤免疫調節發揮重要作用，激活CLR可增強免疫細胞的吞噬作用，有效提高機體免疫系統功能[24]；VEGF信號通路在血管生成過程中發揮不可替代的作用；Mu等[25]發現鈣調蛋白2（calmodulin2，CALM2）通過調控VEGF等信號通路，增強巨噬細胞極化，進而促進腫瘤組織血管內皮細胞的增殖、遷移；Th17細胞對機體免疫反應和宿主防御至關重要，通過分泌白細胞介素-17對抗細胞外的細菌及霉菌[26-28]。

綜上，本研究利用網絡藥理學方法探討益氣補肺顆粒對肺癌的免疫調節機制，確定藥物關鍵成分為3-甲氧基光甘草定、甘草酚、菜豆醇、7-甲氧基-2-甲基異黃酮和豆甾醇，可通過CLR信號通路、VEGF信號通路、Th17細胞分化、HIF-1信號通路、PI3K/AKT信號通路等作用于STAT3、AKT1、TPK、MAPK3、HSP90AA1等靶點發揮免疫調節作用。

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