Let-7d、α-SMA在主動脈夾層患者中的表達及其臨床意義

曹金龍，馬鴻蘭

西安醫學院第一附屬醫院心血管內科，陜西 西安 710077

主動脈夾層(aortic dissection，AD)是一種在短期內危及生命的血管疾病，其不僅會造成循環系統障礙，還會造成肝腎等重要臟器缺血從而引起嚴重并發癥。AD臨床表現具有多樣化，主要表現為突發胸痛、腹痛、高血壓，并可能表現為神經缺損和暈厥等，從而導致AD 早期確診率較低，易于出現漏診或誤診現象[1]。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)功能為收縮血管、維持血管完整性及血管彈性，是主動脈膜中重要構成成分。α-平滑肌蛋白(α-smooth muscle protein，α-SMA)是VSMC 中普遍存在的一種骨架蛋白，也是VSMC 表型轉化的標志蛋白。在AD 發生、發展中VSMC 轉化和凋亡的表型具有重要的作用，且該過程受到多種信號通路的調節[2]。miRNA 是一種參與多種生物學過程的非編碼RNA，已證實多種miRNA在AD患者組織表達水平異常[3]。研 究 表 明，miR-124、miR-221/222 通過調控VSMC 的增殖、表型和遷移功能的改變，對主動脈中膜的彈性變化產生影響，從而參與AD 的發生[4]。Let-7 是最先在線蟲中發現的一種miRNA，具有高度保守性，在心血管組織中特異性表達，從而參與心血管疾病的病理過程[5]。目前對Let-7 與α-SMA 在AD中的作用研究較少。本研究通過檢測AD 患者血清Let-7d、α-SMA 的表達水平，以探究Let-7d、α-SMA與AD的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年5 月至2022 年5 月西安醫學院第一附屬醫院收治的108 例AD 患者(AD組)為研究對象。納入標準：(1)符合《2014 歐洲心臟病學會主動脈疾病診治指南》的診斷標準[6]；(2)經核磁共振或主動脈CT 血管成像檢查，確診為AD；(3)患者及其家屬簽署知情同意書。排除標準：(1)患有先天性心血管疾病；(2)馬凡氏綜合征等遺傳性血管疾病；(3)肝、腎等功能異常；(4)患有系統性炎癥疾病；(5)創傷性或醫源性夾層。AD 組中男性67 例，女性41 例；年齡32~67歲，平均(51.75±9.63)歲；體質量指數(23.04±1.92)kg/m2。選取同期西安醫學院第一附屬醫院108 例健康體檢者作為對照組，其中男性63 例，女性45例；年齡30~66歲，平均(49.33±8.59)歲；體質量指數(22.62±2.15)kg/m2。兩組受檢者的性別、年齡、體質量指數比較差異均無統計學意義，具有可比性(P>0.05)。本研究經西安醫學院第一附屬醫院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑及儀器 RNA 提取試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)購自日本TAKARA公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；α-SMA酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。NanoDrop NA-2000超微量分光光度計購自美國Thermo Fisher Scientific 公 司；ABI 7500 實 時 熒 光 定 量PCR(qRT-PCR)儀購自美國ABI公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 血液樣品收集與處理 采集AD 組患者及對照組空腹外周血10 mL，轉入無RNA 酶離心管中，3 000×g，4℃，離心15 min，之后將上清液置于新無RNA酶離心管中，于-80℃冰箱中保存。

1.3.2 血清Let-7d 水平檢測 采用qRT-PCR 法檢測血清Let-7d 水平。利用RNA 提取試劑盒，按照說明書操作標準抽提血清總RNA，利用NanoDrop NA-2000超微量分光光度計測定RNA濃度，使用反轉錄試劑盒進行反轉錄得到cDNA，然后按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書配制反應體系，并在ABI 7500實時熒光定量PCR上分析樣品，反應體系共15 μL：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ7.5 μL，cDNA 樣品1μL，上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，補充ddH2O至15 μL。反應條件：95℃60 s；95℃30 s、60℃30 s，共計40個循環。以U6作為內參，采用2-△△CT法分析血清Let-7d的表達水平。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequence

1.3.3 α-SMA 水平檢測 利用ELISA 法檢測血清α-SMA水平，嚴格按照說明書進行操作。

1.4 統計學方法 應用SPSS21.0 統計軟件分析數據。計量資料以均數±標準差(±s)表示，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗；采用Pearson 相關系數法分析AD 患者血清Let-7d 與α-SMA 之間的相關性；繪制受試者工作特征曲線(ROC)評價血清Let-7d、α-SMA 對AD 的診斷價值。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組受檢者的血清Let-7d、α-SMA 水平比較 與對照組比較，AD 組患者血清Let-7d、α-SMA水平明顯降低，差異均具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組受檢者的血清Let-7d、α-SMA水平比較(±s)Table 2 Comparison of serum Let-7d and α-SMA levels between the two groups(±s)

表2 兩組受檢者的血清Let-7d、α-SMA水平比較(±s)Table 2 Comparison of serum Let-7d and α-SMA levels between the two groups(±s)

組別AD組對照組t值P值例數108 108 Let-7d/U6 0.64±0.17 1.03±0.21 15.001 0.001 α-SMA(ng/mL)49.83±8.77 70.61±21.44 9.323 0.001

2.2 血清Let-7d、α-SMA水平與AD患者臨床資料的關系 以AD患者血清中Let-7d表達水平平均數分為Let-7d 高表達組50 例，低表達組58 例；以AD 患者血清中α-SMA 水平平均數分為α-SMA 高表達組57 例，低表達組51 例。AD 患 者血清 中Let-7d、α-SMA 水平與性別、年齡、吸煙、高血壓、Standford 分型有關(P<0.05)，見表3。

表3 血清Let-7d、α-SMA水平與AD患者臨床資料的關系[例(%)]Table 3 Relationship between serum Let-7d,α-SMA levels and clinical data of AD patients[n(%)]

2.3 AD 患者血清Let-7d 與α-SMA 水平的相關性 經Pearson 相關分析結果顯示，AD 患者血清中的Let-7d 與α-SMA 呈正相關(r=0.663，P<0.05)，見圖1。

圖1 AD患者血清Let-7d和α-SMA水平的相關性Figure 1 Correlation between serum Let-7d and α-SMA levels in patients with AD

2.4 血清Let-7d、α-SMA對AD的診斷價值 經ROC 分析結果顯示，血清中Let-7d 水平診斷AD的曲線下面積(AUC)為0.860，敏感度為80.6%，特異性為82.4%，95%置信區間(CI)為0.807~0.912，截斷值為0.83；血清中α-SMA 水平診斷AD 的AUC 為0.807，敏感度為83.3%，特異性為75.0%，95%CI 為0.745~0.868，截斷值為58.86 ng/mL，見表4和圖2。

圖2 ROC曲線分析圖Figure 2 ROC curve analysis chart

表4 血清Let-7d、α-SMA對AD的診斷價值Table 4 Analysis of the diagnostic value of serum Let-7d and α-SMA in AD

2.5 影響AD發生的相關因素 將是否發生AD作為因變量，以性別、年齡、吸煙、血清Let-7d、α-SMA水平作為自變量進行多因素Logistic 回歸分析，結果表明Let-7d、α-SMA 是AD發生的影響因素(P<0.05)，見表5。

表5 影響AD發生的多因素Logistic回歸分析Table 5 Multivariate Logistic regression analysis was used to analyze the influencing factors of AD

3 討論

隨著現代生活節奏的加快，心血管疾病的發病率呈逐年上升趨勢。AD是嚴重威脅人類生命健康的心血管疾病之一，研究表明AD 的發生與性別、年齡、吸煙、高血壓等因素有關[7]。王曉敏等[1]研究表明AD 患者中，男性發病人數多于女性，并且大多患者伴有高血壓病史。此外，伴有馬凡氏綜合征、埃萊爾-當洛綜合征、主動脈瓣二葉式畸形等遺傳病患者易患AD[8]。研究顯示，免疫細胞如巨噬細胞、T 淋巴細胞、中性粒細胞等以及免疫因子包括白細胞介素(ILs)、骨橋蛋白、γ干擾素等免疫炎癥機制與AD 的發生有關[9]。因此，AD 的發生受到個人習慣、遺傳、免疫炎癥等多種因素的影響，發病機制復雜。

血管重構被認為是AD發生的主要因素之一。血管重構指血管舒縮功能紊亂，細胞外機制的合成與降解失衡以及管壁細胞發生增殖、遷移、表型轉化和凋亡[10]。VSMC 位于血管中膜，在正常、成熟的VSMC中主要是以收縮型為主，病理條件下VSMC由收縮型轉化為合成型[11]，血管壁彈性降低，從而可能發生AD。α-SMA 屬于肌動蛋白亞類，是細胞骨架的主要成分，主要在分化型細胞中表達，是VSMC 早期分化的特異性標志物。Li 等[12]研究發現AD 患者組織中α-SMA 表達降低，VSMC 為去分化型，表明去分化型VSMC 對AD 發病機制中有一定的影響。本研究對AD患者血清α-SMA水平進行檢測，結果表明α-SMA在AD 患者血清中水平降低，與以上研究一致，表明α-SMA 與AD 的病變密切相關。ROC 曲線分析結果表明α-SMA對AD具有診斷價值，敏感度與特異性均較好，提示α-SMA可以作為診斷AD的潛在標志物。

Let-7 家族是一種高度保守性的miRNA，廣泛存在于各種生物體內，能夠參與多個生物學過程。其中，Let-7 是一種腫瘤抑制基因，在腫瘤細胞增殖與分化中有重要作用[13-15]。近年來，隨著對Let-7 研究的深入，發現Let-7 在VSMC、內皮細胞和心肌細胞中表達，與心血管系統疾病發生發展有密切關系[16]。Wong等[17]研究表明Let-7d-3p表達水平的增加對缺氧肌細胞H9C2 和原代乳鼠心室肌細胞具有保護作用，在心肌缺血和心力衰竭疾病中是潛在治療靶點。另有學者通過對AD患者血清5種miRNA的表達水平進行分析，發現其表達水平均下降，并認為血清miRNA(has-miR-26a-5p、has-miR-191-5p、has-miR-143-3p、has-miR-21-5p、has-miR-223-3p)有作為AD早期快速診斷生物標志物的應用潛能[18]。本研究通過對AD 患者血清Let-7d 表達水平進行檢測，發現Let-7d 在AD 患者血清中表達水平降低，提示Let-7d 可能是檢測AD 的潛在標志物。Sung等[19]研究表明，骨髓間充質干細胞Let-7表達下調，IL-6 表達上調，二者呈現負相關。免疫因子參與AD 的炎癥反應，IL-6 的減少會延緩AD的發生，猜測Let-7d 可能通過調節炎癥水平變化，從而對AD 產生抑制作用[20]。ROC 曲線分析表明Let-7d 對AD 具有診斷價值，敏感度與特異性均較好。本研究中AD患者血清中Let-7d、α-SMA 水平與性別、年齡、吸煙、高血壓、Standford分型有關，提示血清Let-7d、α-SMA 水平與AD 患者個人生活習慣、Standford分型有關。對Let-7d與α-SMA進行相關性分析發現，Let-7d 與α-SMA 存在明顯正相關，提示Let-7d、α-SMA 可能參與AD 發病過程。本研究通過Logistic 分析表明，α-SMA、Let-7d 是AD 的影響因素，表明二者在AD 發生發展中起著重要作用，雖然有關α-SMA、Let-7d 與AD 病變機制尚不清楚，但通過本研究可為臨床對AD 進行診斷、治療、新藥物研發提供思路。

綜上所述，AD患者血清Let-7d、α-SMA表達水平降低，Let-7d、α-SMA 是AD 發生的影響因素，可作為評估AD 發生的血清學指標。本研究尚存在不足之處，如Let-7d、α-SMA 在AD 疾病中發揮作用的確切機制需待進一步研究。