恩度抑制大鼠肝纖維化與肝癌的機制研究

楊國威，杜瑩瑩，程序，譚莉霞，王航宇，董勇，仝甲釗，武利萍

河南大學第一附屬醫(yī)院消化內科，河南 開封 475001

肝癌為導致全球患者死亡第二大癌癥，我國肝癌發(fā)病率、中標率及世標率分別為24.09/10 萬、12.73/10 萬、13.89/10 萬，由其所致疾病與經(jīng)濟負擔逐漸成為重要公共衛(wèi)生問題[1]。研究顯示超過80%肝癌患者病情進展經(jīng)歷了慢性肝炎、肝纖維化、肝癌這一逐步進展過程[2]。研究者們近期嘗試從分子層面解釋肝纖維化-肝癌發(fā)生具體機制，以便通過靶向特定分子延緩甚至阻斷肝臟疾病進展[3]。轉化生長因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)為促進肝纖維化獨有因子，其涉及TGF-β/Smad 信號通路介導了肝纖維化-肝癌過程[4]。恩度可以經(jīng)由抑制TGF-β表達而減輕TGF-β誘導纖維化作用，進而發(fā)揮明顯抗纖維化作用[5]。基于此，本研究探究恩度對大鼠“肝纖維化-肝癌”抑制作用及具體作用機制，為后期肝癌抗腫瘤治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠90 只，體質量180~200 g，在醫(yī)院動物房以標準飼料分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度20℃~25℃，可以自由進食飲水，光照與黑暗時間均為12 h。

1.2 儀器與試劑 JA1003 型號天平購自上海精科儀器有限公司，光學顯微鏡購自日本奧林巴斯公司，Multiskan MK3 型號酶標儀購自Thermo Labsystems 公司，LEICARM2035 型號生物組織石蠟切片機購自湖北孝感市亞光醫(yī)用電子技術有限公司，BM-Ⅱ型號包埋機購自安徽電子科學研究院，IQTM5 型號實時熒光逆轉錄酶鏈聚合反應(RT-PCR)購自美國Bio-Rad 公司，DYY-8B 型電泳儀購自北京六一儀器廠，Tanon 型號凝膠成像分析儀購自上海天能科技有限公司；DEN 購自美國Sigma 公司，恩度購自山東先聲麥得津生物制藥有限公司，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)素購自BASO 生物科技有限公司，谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、白 蛋 白(albumin，ALB)、總膽紅素(total bilirubin，TBI)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒均購自四川邁克生物科技股份有限公司，羥脯氨酸及堿性磷酸酶試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，Trizol 試劑盒、High-capacity cDNA reverse transcription kits均購自美國Gene Copoeia公司，蛋白裂解液、二辛可寧酸(bicinchoninic acid assay，BCA)試劑盒均購自金克隆(北京)生物技術有限公司，兔TGF-β1、轉化生長因子-β受體Ⅰ(transforming growth factor-β recipient Ⅰ，TβRⅠ)、轉化生長因子-β受體Ⅱ(TβRⅡ)、Smad2/3 均購自美國Cell Signaling Technology 公司，小鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司，辣根過氧化酶標記山羊抗兔、抗小鼠抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司，發(fā)光液購自北京伊塔生物科技有限公司。

1.3 大鼠模型構建及分組 90 只小鼠在動物房適應性飼養(yǎng)1周，將所有小鼠隨機分為正常組、模型組、恩度組，每組30只。模型組以10 mg/kg濃度腹腔注射0.2%DEN，每周5次，連續(xù)注射16周，對照組以9 g/L濃度注射等量注射生理鹽水，于8 周、12 周、16周分別處死5只進行病理檢測，以明確預期病理分型。確定病理分型后恩度組于尾靜脈以20 mg/(kg·d)劑量注射恩度，此時對照組與模型組注射等量9 g/L濃度生理鹽水，繼續(xù)注射，飼養(yǎng)至20周處死小鼠。小鼠處死前收集心臟血測定肝功能指標及纖維化指標，處死后獲得肝臟組織行病理檢測與相關信號通路mRNA及蛋白測定。

1.4 肝組織大體形態(tài)觀察 觀察8 周、12 周、16周及20周處死大鼠完整肝臟組織，統(tǒng)計肝表面結節(jié)數(shù)量，將大鼠肝組織腫瘤剝離，稱重肝組織腫瘤，統(tǒng)計瘤重、肝臟指數(shù)、抑瘤率，肝臟指數(shù)=肝臟組織重量/總重量×100%，抑瘤率=(模型組瘤重-恩度組瘤重)/模型組瘤重×100%。

1.5 肝組織病理檢測 恩度注射4 周后將大鼠處死后收集肝組織應用4%多聚甲醛固定后行石蠟包埋、切片、脫蠟、水化、HE染色、脫水、封片等處理，隨后置于光學顯微鏡下觀察拍片，并行肝纖維化分級[6]評估，0 級為組織中無纖維化，1 級為肝小葉中有纖維瘢痕或者肝竇附近及匯管區(qū)出現(xiàn)纖維化，2 級為大部分肝小葉結構完整，但是可以觀察到纖維存在間隔，3級為肝小葉可以觀察到紊亂，纖維間間隔較多，但是未達到硬化標準，4級為肝實質損傷，出現(xiàn)纖維彌漫性增生，可見假小葉，且肝組織顯示為肝硬化前期，0 級、1 級、2級、3級與4級分別計分0分、1分、2分、3分、4分。

1.6 肝功能指標及纖維化指標測定 最后一次給藥結束后第2天，以50 mg/kg劑量腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉處理大鼠收集心臟血500 μL，離心后獲得血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定ALT、AST、ALB、TBI等肝功能指標。采用比色法測定羥脯氨酸及堿性磷酸酶等纖維化指標水平。

1.7 肝 組 織 中TGF-β/T β R/Smad2/3 信 號 通 路mRNA水平測定 肝臟組織TGF-β1、TβRⅠ)、TβRⅡ、Smad2/3 mRNA 水平采用RT-PCR 測定。肝臟組織100 mg 勻漿處理后采用Trizol 試劑盒進行總RNA 抽提，抽提后采用DEPC 水溶解后在紫外分光光度計上進行總RNA 濃度測定。依據(jù)High-capacity cDNA reverse transcription kits進行mRNA反轉錄。在RT-PCR儀上進行RT-PCR 擴增，反應條件設置為：在95℃、95℃、60℃分別處理30 s、5 s、34 s，一共需要循環(huán)40次，引物序列見表1。內參選擇GAPDH，最終結果采用2-ΔΔCt計算。

表1 各引物序列Table 1 Primer sequences

1.8 肝組織中相關信號通路蛋白表達測定 肝臟組織TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2/3 蛋白水平采用蛋白印跡法進行測定。小鼠肝臟組織剪碎后置于蛋白裂解液中獲得總蛋白，采用BCA試劑盒確定提取蛋白濃度，置于沸水浴中加熱10 min，電泳后進行轉膜處理，蛋白應用5%脫脂牛奶置于室溫下封閉處理1 h，加入一抗后置于4℃過夜處理，第2天應用磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，隨后添加對應二抗，室溫環(huán)境孵育1 h，磷酸緩沖鹽溶液沖洗3 次添加發(fā)光液予以顯色，GAPDH 為內參。凝膠成像系統(tǒng)拍照后采用Image J軟件進行分析。

1.9 統(tǒng)計學方法 應用SPSS20.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠肝臟組織病理學染色情況比較 HE染色可見正常組織內部肝細胞規(guī)律整齊排列，肝葉結構完整(圖1A)；模型組可以肝組織結構異常，存在大量無序假小葉結構，小葉內部可以明顯觀察到纖維化和局灶性細胞壞死，其中存在大量炎癥細胞浸潤，可見異型細胞，細胞的細胞核呈不規(guī)則狀(非典型性癌灶)，肝小葉結構出現(xiàn)不同情況損傷(圖1B)；恩度組雖然依然可見肝細胞損傷及炎癥細胞浸潤，但是損傷較模型組輕，肝纖維化程度低，假小葉形成不明顯(圖1C)。

圖1 HE染色(40×)Figure 1 HE staining(40×)

2.2 三組大鼠肝組織肝臟纖維化分級、肝臟指數(shù)及腫瘤情況比較 恩度組大鼠肝臟纖維化分級、肝臟指數(shù)、結節(jié)數(shù)、瘤重明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而恩度組與模型組大鼠肝臟指數(shù)均高于正常組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 本組大鼠肝組織肝臟纖維化分級、肝臟指數(shù)及腫瘤情況比較(±s)Table 2 Comparison of the grade of liver fibrosis,liver index,and tumors among the three groups(±s)

表2 本組大鼠肝組織肝臟纖維化分級、肝臟指數(shù)及腫瘤情況比較(±s)Table 2 Comparison of the grade of liver fibrosis,liver index,and tumors among the three groups(±s)

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。Note:Compared with the normal group,aP<0.05;Compared with the model group,bP<0.05.

組別正常組模型組恩度組t/F值P值只數(shù)抑瘤率(%)5 5 5肝臟纖維化分級-4.00±0.71 2.60±0.55b 3.486 0.008肝臟指數(shù)(%)1.56±0.29 5.19±0.72a 3.97±0.51ab 59.336 0.001結節(jié)數(shù)(個)-10.82±2.67 7.43±1.82b 2.346 0.047瘤重(g)-2.95±0.33 1.52±0.39b 6.259 0.001--18.26±3.86--

2.3 三組大鼠的肝功能比較 模型組大鼠的ALT、AST、TBI 水平明顯高于正常組，ALB 水平明顯低于正常組，而恩度組大鼠的ALT、AST、TBI 水平明顯低于模型組，ALB 水平明顯高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 三組大鼠的肝功能比較(±s)Table 3 Comparison of liver function among the three groups(±s)

表3 三組大鼠的肝功能比較(±s)Table 3 Comparison of liver function among the three groups(±s)

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。Note:Compared with the normal group,aP<0.05;Compared with the model group,bP<0.05.

組別正常組模型組恩度組F值P值只數(shù)5 5 5 ALT(U/L)36.52±4.01 88.56±9.87a 64.85±7.12b 62.015 0.001 AST(U/L)58.63±6.25 176.21±18.60a 109.58±11.36b 101.447 0.001 TBI(μmmol/g)4.36±0.58 11.14±1.26a 7.59±1.39b 44.737 0.001 ALB(g/L)44.85±4.85 22.74±2.39a 38.52±4.06b 42.539 0.001

2.4 三組大鼠的肝組織纖維化情況比較 模型組大鼠羥脯氨酸、堿性磷酸酶水平明顯高于正常組，恩度組大鼠羥脯氨酸、堿性磷酸酶水平明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 三組大鼠的肝組織纖維化情況比較(±s)Table 4 Comparison of liver fibrosis among the three groups(±s)

表4 三組大鼠的肝組織纖維化情況比較(±s)Table 4 Comparison of liver fibrosis among the three groups(±s)

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。Note: Compared with the normal group,aP<0.05; Compared with the model group,bP<0.05.

組別正常組模型組恩度組F值P值堿性磷酸酶(kU/L)2.65±0.39 6.76±0.68a 5.32±0.61b 66.123 0.001只數(shù)5 5 5羥脯氨酸(μg/g)2.41±0.32 6.85±0.74a 4.26±0.51b 81.981 0.001

2.5 三組大鼠肝組織中TGF-β/TβR/Smad2/3信號通路mRNA 水平比較 模型組大鼠TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2/3 等mRNA 水平明顯高于正常組，而恩度組大鼠的TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2/3等mRNA水平均明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表5。

表5 三組大鼠肝組織中TGF-β/TβR/Smad2/3 信號通路mRNA水平比較(±s)Table 5 Comparison of TGF-β/T β R/Smad2/3 signaling pathway mRNA levels in liver tissues of the three groups(±s)

表5 三組大鼠肝組織中TGF-β/TβR/Smad2/3 信號通路mRNA水平比較(±s)Table 5 Comparison of TGF-β/T β R/Smad2/3 signaling pathway mRNA levels in liver tissues of the three groups(±s)

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。Note: Compared with the normal group,aP<0.05; Compared with the model group,bP<0.05.

組別正常組模型組恩度組F值P值0.94±0.13 2.24±0.34a 1.76±0.18b 41.025 0.001 5 5 5 1.72±0.22 3.36±0.42a 2.32±0.31b 32.184 0.001 0.95±0.12 2.86±0.47a 1.74±0.19b 50.908 0.001 0.91±0.10 2.92±0.36a 1.71±0.20b 85.526 0.001 Smad2/3只數(shù)TGF-β(ng/mL)TβRⅠTβRⅡ

3 討論

DEN 所致肝癌模型與人體肝癌發(fā)生進展過程相似，為探究肝癌發(fā)生進展機制及篩選肝癌治療潛在藥物[7]，本研究選擇DEN 誘導肝癌大鼠模型作為研究對象。在應用DEN處理后，模型組大鼠可見肝臟組織表面逐漸粗糙，可見結節(jié)存在，結節(jié)數(shù)量隨著飼養(yǎng)時間延長而變多，結節(jié)大小不一，顯示大鼠肝組織出現(xiàn)癌變變化。HE 染色可見，模型組大鼠肝臟組織結構中存在大量無序假小葉結構，其內浸潤有大量炎癥細胞，伴有大量異型癌灶細胞，這些細胞細胞核形狀不規(guī)則，顯示DEN誘導肝癌模型成功。

恩度作為血管內皮抑制劑，已被應用于多種腫瘤治療中，目前研究證實其可以經(jīng)由阻斷血管內皮生長因子受體磷酸化過程，將新生血管形成信號傳導過程阻斷，進而發(fā)揮明顯抗腫瘤作用[8-9]。本研究中恩度組大鼠肝臟纖維化分級、肝臟指數(shù)、結節(jié)數(shù)、瘤重均低于模型組，恩度組大鼠抑瘤率為(18.26±3.86)%，顯示重組人血管內皮抑制素恩度確實可以發(fā)揮抑制腫瘤生長作用。吳占慶等[10]研究顯示中晚期原發(fā)性肝癌采用重組人血管內皮抑制素治療可以經(jīng)由抑制新生血管形成，阻斷病灶營養(yǎng)，發(fā)揮顯著抗腫瘤作用。研究顯示肝細胞癌進展過程包括慢性肝炎、肝纖維化、肝硬化等諸多過程，其中羥脯氨酸作為形成膠原重要氨基酸，堿性磷酸酶在肝細胞損傷或者癌變情況下釋放異常增多[11]。本研究中肝癌大鼠應用恩度處理后，羥脯氨酸、堿性磷酸酶等纖維化指標水平下降，顯示恩度有效抑制肝癌大鼠肝纖維化進程，既往研究中恩度經(jīng)由抑制新生血管生成發(fā)揮抗腫瘤作用[12]，本研究中恩度可能通過減輕肝癌大鼠肝臟損傷及纖維化程度發(fā)揮顯著抗腫瘤作用。

為明確恩度對肝癌大鼠抗纖維化-抗腫瘤具體作用機制，本研究測定了大鼠TGF-β/TβR/Smad2/3 信號通路mRNA 及相關蛋白水平。本研究中模型組大鼠TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ等mRNA水平均顯著高于正常組，分析認為TGF-β可以促進肝星狀細胞活化，促進膠原蛋白分泌，抑制膠原蛋白水解酶活性，使細胞外基質降解及合成平衡被打破，并在組織間隙沉積，導致肝星狀細胞轉化為肌成纖維細胞，進而使肝臟出現(xiàn)纖維化病變[13]。恩度處理則會抑制肝組織TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ基因水平，TβRⅠ、TβRⅡ為TGF-β受體，為激活下游Smad 信號重要條件[14]，推測恩度抗纖維化-抗腫瘤作用可能與抑制TGF-β及其受體表達有關。TGF-β/Smad 信號通路發(fā)揮作用過程主要為：TGF-β與TβRⅡ結合，隨后募集并活化TβRⅠ，TβRⅠ使Smad2/3激活，形成磷酸化Smad2/3，其后與Smad4構成異源三聚體復合物，復合物入核后可以發(fā)揮調節(jié)目的基因表達情況，胞漿內部Samd7 入核后則會促進復合物解離而中止上述反應[15-17]，因此，推斷恩度下調肝組織TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ表達，進而抑制下游Smad2/3信號通路信號傳導。另有研究顯示α-亞麻酸植物甾醇酯有助于改善小鼠肝纖維化，這一作用與α-亞麻酸植物甾醇酯下調TGF-β1表達并抑制下游靶分子Smad蛋白表達關系密切[18]，與本研究中相關結論類似。Yang等[19]研究也顯示在肝臟疾病的發(fā)生過程中，TGF-β信號轉導介質Smads受到結構域特異性位點磷酸化的嚴格控制，Smad3 磷酸亞型pSmad3L 和pSmad3C 是可逆的和拮抗的；pSmad2L/C 可通過刺激細胞外基質合成，與pSmad3L 共同作用，介導肝組織纖維化過程，與本研究中相關結論一致。

綜上所述，恩度可以明顯抑制DEN誘導大鼠肝纖維化-肝癌過程，其作用機制可能與抑制TGF-β及相應受體表達、調控下游Samd2/3 信號激活有關。本研究雖然證實恩度可以發(fā)揮明顯抗纖維化-肝癌作用，但是并未明確采用何種濃度恩度處理才可發(fā)揮最佳抗纖維化-肝癌效果，這將是下一步研究關注重點。