市售11種煎煮類中藥飲片微生物污染情況考察

楊昊,周爽,楊戈,龐慶林,張蕾

(江蘇省食品藥品監督檢驗研究院,國家藥品監督管理局化學藥品雜質譜研究重點實驗室,江蘇 南京 210019)

中藥飲片是指藥材經過炮制后可直接用于中醫臨床或制劑生產使用的藥品[1]。中藥飲片絕大部分來源于動物、植物或礦物,炮制方法有凈制、切制、蒸煮、發酵等,其自身的這些特點導致其微生物載量居高不下,所以中藥飲片的衛生質量一直是風險隱患之一。近年來,隨著中醫藥行業在世界臨床醫學地位和國際影響力進一步提升[2],中藥飲片的質量控制越發重要。但《中國藥典》2020年版僅對中藥提取物、直接口服及泡服飲片等做了微生物限度規定,而臨床應用最廣的煎煮類飲片未規定限度標準[3]。煎煮類中藥飲片品種繁多、炮制方法多樣,短時間內難以制定統一標準。本研究通過分析11種煎煮類中藥飲片的微生物污染情況,研究多種類別飲片的微生物負載水平,為今后《中國藥典》中藥飲片微生物限度標準的制修訂提供數據支撐,為監管工作的開展提供技術支持。

1 儀器與材料

1.1 儀器 生物安全柜(Thermo,AII級);生化培養箱(Memmert IF450PLUS和HHP400);顯微鏡(Nikon Eclipse 55i);VITEK2全自動細菌鑒定系統(Biomerieux,Vitek 2 compact15);水浴恒溫振蕩器(Memmert WNB45)。

1.2 試劑 胰酪大豆胨瓊脂培養基(批號：20170108)、胰酪大豆胨液體培養基(批號：20170102)、沙氏葡萄糖肉湯培養基(批號 ：20160112)、沙氏葡萄糖瓊脂培養基(含抗生素)(批號：20170120)、腸道菌增菌液體培養基(批號：20160701)、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基(批號：20160728)、麥康凱瓊脂培養基(批號：20151012)、麥康凱液體培養基(批號：20161222)、RV沙門菌增菌液體培養基(批號：20151019)、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂培養基(批號：20160327)、三糖鐵瓊脂培養基(批號：20161016),均為干粉培養基,按《中國藥典》2020年版(四部)通則[4]進行配制、滅菌,培養基適用性檢查均合格。MUG培養基(批號：161225),沙門氏菌干制生化鑒定盒(批號：161124),大腸埃希氏菌干制生化鑒定盒(批號：161104),以上購自北京陸橋技術有限公司。

1.3 試驗樣品 中藥飲片購自醫院、市各大藥房(南京大華中藥店、益豐大藥房、樂富來大藥房、先聲再康藥店等)、飲片廠、藥企等。來源于不同產地,均為植物類,有根類、莖類、花類、果實類、種子類等,共11個品種101批次,詳見表1。

表1 11種煎煮類中藥飲片樣品信息

1.4 菌種和菌液制備 大腸埃希菌[CMCC(44102)]、乙型副傷寒沙門菌[CMCC(B)50094]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104],以上菌種購自中國醫學細菌管理保藏中心,均為第3代,經菌種驗收合格。

2 方法

本試驗的所有培養基和101批飲片樣品均按照《中國藥典》2020年版(四部)通則1108“中藥飲片微生物限度檢查法”進行了培養基適用性試驗和中藥飲片的方法適用性試驗。結果表明,培養基均符合要求,且飲片樣品的方法適用性良好。

2.1 供試液制備 取25 g供試品,加入225 mL胰酪大豆胨液體培養基,制成1∶10供試液,45 ℃水浴振蕩不少于15 min。

2.2 需氧菌總數TAMC,霉菌和酵母菌總數TYMC和耐熱菌NAIRE的測定方法按照《中國藥典》 2020 年版(四部)通則1108“中藥飲片微生物限度檢查法”。取1∶10供試液1 mL及5～7個連續稀釋級10倍遞增稀釋,每個稀釋級制備2個平皿,以TSA和含0.1‰氯霉素的SDA注皿,培養至規定時長得到TAMC和TYMC。另取1∶10供試液于冷水中,加熱煮沸30 min,迅速冷卻后,同TAMC測定法進行耐熱菌數測定。結果以常用對數形式表示。

2.3 控制菌的檢查

2.3.1 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查 參照《中國藥典》2020年版(四部)通則1108“中藥飲片微生物限度檢查法”進行耐膽鹽革蘭陰性菌檢查。取相當于0.1、0.01和0.001 g……(連續5～7個稀釋級)的預培養供試液及其稀釋液。

2.3.2 大腸埃希菌檢查 取“2.1”項下1∶10的供試液10 mL,參照《中國藥典》2020年版(四部)通則1108“中藥飲片微生物限度檢查法”檢查大腸埃希菌。

2.3.3 沙門菌檢查 參照《中國藥典》2020年版通則1108“中藥飲片微生物限度檢查法”檢查沙門菌。

2.4 微生物限度判定參考標準 《美國藥典》(USP43)、《歐洲藥典》(EP10.0)、《日本藥典》(JP17)中對與煎煮類中藥飲片相當的植物藥(天然藥物)的微生物限度標準做了規定,結果見表2。

表2 USP43、EP10.0和JP17中植物藥(天然藥物)微生物限度標準

2.5 統計學方法 利用統計學SPSS 13.0軟件對數據結果進行統計與分析。

3 結果

3.1 中藥飲片中需氧菌總數(TAMC)的檢查結果 101批飲片樣品的lgTAMC(需氧菌總數的lg值)均值為3.6,小于6.0,表明中藥飲片樣品的需氧菌總數總體水平符合美國、歐洲和日本藥典標準;lgTAMC的最大值在7.2,說明有部分樣品超出美國、歐洲和日本藥典標準,為不合格飲片樣品。lgTAMC的最大值與最小值差為5.9,表明飲片受微生物污染程度差距相當大。以101批中藥飲片的需氧菌總數的對數值為橫坐標、lgTAMC頻率為縱坐標,畫出直方圖和分布曲線(見圖1),由圖可知101批中藥飲片中,90%lgTAMC值小于6.0,符合美國、歐洲和日本藥典標準。以中藥飲片品種為橫坐標、需氧菌總數的對數值為縱坐標作箱式圖(結果見圖2),由圖2可知,姜半夏(S2)lgTAMC值為1.3～2.3、法半夏(S3)lgTAMC值為2～2.4、梔子(S4)lgTAMC值為2.1～2.8、生天南星(S9)lgTAMC值為2.3～2.8,表明這4個品種微生物污染水平低,且批間差異小,質量穩定;制天南星(S8)lgTAMC值為2.1～6,該品種污染微生物的批間差異最大,質量最不穩定;鹽車前子(S6)的lgTAMC值相較車前子(S5)的lgTAMC值明顯降低,對S6和S5兩種中藥飲片進行獨立樣本T檢驗,P<0.05存在顯著性差異,表明飲片樣品的炮制工藝如鹽炒等加熱炮制工藝可降低TAMC生物負載;地膚子(S10)lgTAMC值為4.1～7.2,在本次檢測的所有飲片樣品中最高,均值與中位數也高出其他所有飲片樣品,表明其TAMC生物負載相當高,部分樣品超出了美國、歐洲和日本藥典標準,即不符合三國藥典標準。

圖1 101批中藥飲片樣品lgTAMC分析

圖2 中藥飲片不同品種lgTAMC分析

3.2 中藥飲片霉菌和酵母菌總數(TYMC)檢查結果 101批飲片樣品的lgTYMC(霉菌和酵母菌總數的lg值)均值為2.3,中位數為1.9,低于4.0,表明中藥飲片樣品的TYMC總體水平符合美國、歐洲和日本藥典標準;lgTYMC的最大值在5.7,說明也有部分樣品超出美國、歐洲和日本藥典標準,為不合格飲片樣品。lgTYMC的最大值與最小值差為5.2,表明飲片受微生物污染水平差距相當大。以101批中藥飲片的霉菌和酵母菌總數的對數值為橫坐標、lgTYMC頻率為縱坐標,畫出直方圖和分布曲線(見圖3);可知101批中藥飲片中,80%lgTYMC值小于5.0,符合《歐洲藥典》和《日本藥典》標準,65%lgTYMC值小于4.0,符合《美國藥典》標準。以中藥飲片的品種為橫坐標、lgTAMC值為縱坐標,作箱式圖(見圖4)。由圖4可知,在11種中藥飲片的lgTYMC均值中僅有1批(地膚子S10)超過4.0,表明這11種中藥飲片的TYMC生物負載相對較低。生天南星(S9)和太子參(S11)的lgTYMC值在1.0～1.9之間,表明這兩個品種TYMC污染水平較低,批間差異小,質量穩定;天花粉(S7)的lgTYMC值在1.3～3.9之間,表明其TYMC污染水平批間差異大,質量最不穩定;鹽車前子(S6)的lgTYMC值相較車前子(S5)的lgTYMC值明顯降低,對S6和S5兩種中藥飲片進行獨立樣本T檢驗,結果與TAMC生物負載情況一樣,P值<0.05,存在顯著性差異,表明飲片樣品的炮制工藝如鹽炒等加熱炮制工藝可降低中藥飲片TYMC生物負載;地膚子(S10)lgTYMC值為3.0～5.7,在本次檢測中遠高出其他飲片樣品,表明其TYMC生物負載相當高, lgTYMC的中位數為4.2,即一半以上的地膚子飲片不符合《美國藥典》標準。

圖3 101批中藥飲片樣品lgTYMC分析

圖4 中藥飲片不同品種lgTYMC分析

3.3 中藥飲片耐熱菌數(NAIRE)檢查結果 101批飲片樣品的lgNAIRE(耐熱菌總數的lg值)均值為1.5,中位數為1.3,整體水平較之lgTAMC值均有大幅下降,平均下降2～3個數量級。以101批中藥飲片的耐熱菌總數的對數值為橫坐標、lgNAIRE頻率為縱坐標,畫出直方圖和分布曲線(見圖5);以中藥飲片品種為橫坐標、耐熱菌總數的對數值為縱坐標作箱式圖(見圖6)。由圖5及圖6可知,中藥飲片樣品按《中國藥典》方法在經過100 ℃ 30 min處理后所有樣品仍有耐熱菌檢出,但與未熱處理的需氧菌數相比有明顯下降,熱處理后35%左右的lgNAIRE值在1.0以下,65%以上的lgNAIRE值降到2.0以下,僅有不足5%飲片樣品的lgNAIRE值大于5.0?？梢姛崽幚韺υ?1個品種的中藥飲片lgNAIRE均有一定的降低作用。對部分污染較為嚴重的中藥飲片進行了耐熱菌的分離鑒定,鑒定結果顯示,耐熱菌大部分為芽孢桿菌,車前子中檢出嗜熱芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和環狀芽孢桿菌等;地膚子中檢出嗜熱芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌;天花粉中檢出枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。這些芽孢桿菌本身耐熱性強,不易被殺滅,因此熱處理對該類菌滅活效果不理想,仍有細菌毒素等潛在安全風險存在的可能性?，F行各國藥典對耐熱菌的控制均未有相關規范和檢查標準,這也是中藥飲片質量標準長久以來難以確定的難點之一,煎煮類中藥飲片日常服用時也僅通過簡單的煎煮,還是存在一定的生物安全風險,因此中藥飲片中的耐熱菌污染需引起足夠重視,健全相關法規。

圖5 101批中藥飲片樣品lgNAIRE分析

圖6 中藥飲片不同品種lgNAIRE分析

3.4 中藥飲片控制菌檢查結果 《中國藥典》2020年版(四部)通則1107“微生物限度標準”中對直接口服及泡服飲片的控制菌作出相關規定：不得檢出大腸埃希菌(1 g或1 mL);不得檢出沙門菌(10 g或10 mL);耐膽鹽革蘭陰性菌應小于104cfu(1 g或1 mL)。對中藥提取物和煎煮類中藥飲片未作規定。本實驗以此標準為參考判定依據。

3.4.1 耐膽鹽革蘭陰性菌(G-) 對耐膽鹽革蘭陰性菌計數結果(G-)進行分析統計,G-計數結果<10 cfu·g-1以lg值0.5計,10 cfu·g-1< G-<102cfu·g-1以lg值1.5計,102cfu·g-1< G-<103cfu·g-1以lg值2.5計,以此類推,做箱式圖(見圖7)。由圖7可知,姜半夏(S2)、法半夏(S3)、生天南星(S9)的lgG-值較低,大部分的G-<10,鹽車前子(S6)、制天南星(S8)的lgG-值相對較低,大部分的G-<102;夏枯草(S1)、梔子(S4)、太子參(S11)的lgG-值較高(G-<104),符合《中國藥典》2020年版(四部)通則1107中同類標準規定(直接口服及泡服飲片);車前子(S5)、天花粉(S7)、地膚子(S10)的lgG-值很高(G-<105),其中車前子有2批、天花粉有2批、地膚子有9批結果G->104,不符合《中國藥典》2020年版(四部)通則1107中同類標準規定(直接口服及泡服飲片)。此外,lgG-值與lgTAMC值存在一定的正相關性,即lgTAMC值較高的中藥飲片,一般lgG-值也較高。對紫紅膽鹽平皿上分離出的耐膽鹽革蘭陰性菌進行鑒定,其中車前子中檢出陰溝腸桿菌、傷口埃希菌、泛菌屬以及肺炎克雷伯菌等;地膚子中檢出陰溝腸桿菌、泛菌屬和阪崎腸桿菌;天花粉中檢出陰溝腸桿菌、泛菌屬和肺炎克雷伯菌,均為致病菌或條件致病菌[4-7]。

圖7 中藥飲片不同品種lgG-分析

3.4.2 大腸埃希菌、沙門菌 101批中藥飲片中有13批檢出大腸埃希菌,包含夏枯草、車前子和地膚子;檢出沙門菌的為地膚子3批,且其中2批同時檢出大腸埃希菌。從本次實驗結果也可以看出,地膚子中藥飲片這一品種生物負載較高,TAMC、TYMC、NAIRE及G-也均高于其余品種的中藥飲片,這也與該品種的自身特點及炮制工藝有關。

4 討論

本研究通過對11個品種共計101批煎煮類中藥飲片進行微生物污染程度的考察,初步建立了相關品種的微生物負載數據庫。這11個品種的中藥飲片均為煎煮類,《中國藥典》2020年版(四部)通則僅對中藥提取物和直接口服及泡服飲片做了微生物限度標準的規定,煎煮類中藥飲片還未出臺相關微生物限度標準。在現行各國藥典標準中,USP、EP、JP對與煎煮類中藥飲片相當的植物藥(天然藥物)的微生物限度均有規定,其中美國對使用前用沸水處理的植物產品工藝要求不同[4],故USP43制訂的標準較為嚴格,微生物限度比JP17和EP10.0低了1個數量級。上述101批中藥飲片符合USP標準的為52批,合格率僅為51.5%;符合EP10.0和JP17標準的為99批,合格率98.0%。這些飲片問題項目主要體現在需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數及耐膽鹽革蘭陰性菌的微生物負載較高。

從藥材類別來看,礦物藥的微生物負載較低,植物藥和動物藥微生物負載較高,植物藥和動物藥的微生物負載無顯著性差異,這與微生物的生長過程中受藥材成分影響相關,不同種類微生物對藥材種類有選擇特異性[8];對植物藥,通常全草類、花粉類、種子類、塊根類中藥飲片微生物負載較高,皮類、莖類、果實類中藥飲片微生物負載相對較低;中藥飲片中有抑菌成分的品種微生物負載較低[9];不同產地加工及炮制方法對微生物的污染情況也有影響,直接切制、曬干的中藥飲片微生物負載較高,煮制、炒制和蒸制等涉及熱炮制工藝的中藥飲片微生物負載較低,如本研究中的車前子和鹽車前子(熱炮制工藝)的微生物負載就存在顯著性差異(P<0.05)。

中藥作為我國古代文化傳承的瑰寶,我國藥典中收載的藥材品種要遠遠多于國外藥典,目前已有直接口服及泡服中藥飲片標準,但煎煮類中藥飲片還缺少相關標準限度進行監管,微生物風險長期存在。煎煮類中藥飲片涉及面廣,日常需求量大,因此煎煮類中藥飲片微生物污染數據的積累和微生物危害的風險評估工作更加迫在眉睫。作為中藥大國,我們目前應多積累國內各中藥飲片相關的微生物污染數據,分析各個品種的微生物負載水平和影響因素[10],才能在中藥飲片各個環節的關鍵點進行把控,指導完善飲片的合理加工炮制、企業的規范生產、流通環節的科學儲運等,為完善中藥材監管打下基礎。這是中國藥典的中藥標準引領國際中藥發展的必經之路[11],也是中藥走向世界的關鍵。