黃芪對急性輻射損傷小鼠預防作用的研究

韋唯唯,鄭祖安,王佳偉,杜光

(1.湖北科技學院醫學部藥學院,湖北 咸寧 437100;2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院腫瘤科,湖北 武漢 430030;3.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院藥學部,湖北 武漢 430030;4.國家重大公共衛生事件醫學中心,湖北 武漢 430030)

隨著核技術在醫學、國防、農業生產等領域的廣泛應用,核輻射日益成為威脅人類健康的重要因素,對造血系統和免疫系統均造成損傷,嚴重者誘發出血、貧血、感染甚至死亡等并發癥[1-3]。研究發現,黃芪多糖(APS)可增加免疫器官重量,提高免疫器官指數[4]。也可在體外刺激RAW 264.7巨噬細胞分泌免疫調節因子NO、IL-1β、IL-6和TNF-α[5]。本文主要研究黃芪對輻射損傷小鼠的免疫器官損傷及外周血細胞減少的預防作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 30只SPF級雄性Balb/c小鼠,6周齡,體質量(20±2)g,由成都藥康生物科技有限公司提供,動物生產許可證號：SCXK(川)2020-034。動物使用許可證編號：SYXK(鄂)2019-0106。飼養于華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院科研樓SPF級動物房。

1.1.2 實驗藥物與試劑 黃芪(批號：211001,武漢同濟醫院中心藥房);氯化鈉注射液(批號：00078,武漢擇而優科技發展有限公司);乙醇(批號：10009218,國藥);二甲苯(批號：10023418,國藥);蘇木素染液(批號：BA-4041,貝索生物);環保封片劑 (武漢同聲科技);石蠟 (廣東大川特種有限公司);Harris蘇木素染色液(批號：BA4041,貝索生物);醇溶性伊紅(批號：AIGMA-230251);鹽酸(批號：10011028,國藥)。

1.1.3 實驗儀器 X直線加速器(中法院區同濟醫院腫瘤放療科提供);天平(型號：JA2003,YUEPING);生物安全柜(青島海爾特種電器有限公司);倒置顯微鏡(深圳市奧斯微光學儀器有限公司);數顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);超優刀片(批號：超優刀片325,Thermo);石蠟切片機(型號：Shandon Finesse 325,Thermo);顯微鏡(型號：CX31,奧林巴斯),包埋機(型號：BMJ-A,常州市中威電子儀器有限公司);病理組織漂烘儀(型號：PHY-III,常州市中威電子儀器有限公司);顯微鏡載玻片(批號：TS-NRS029,南通天盛新能源科技有限公司);高品質顯微鏡蓋玻片(批號：10212432C,世泰)。

1.1.4 藥物制作方法 黃芪購自湖北省武漢市同濟醫院中心藥房,先用蒸餾水浸泡30 min,使其質地松軟,以便活性成分的煎出。因黃芪屬補益類中藥材,宜用文火慢煎。黃芪水煎液濃縮至原藥材的3 g·mL-1。運用等效劑量換算法計算小鼠的灌胃量是人臨床用量的5倍[6]。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型建立、分組及給藥 采用照射劑量為5 Gy,劑量率為6 Gy·min-1對小鼠進行一次性全身照射,建立急性輻射損傷模型[7]。

1.2.2 分組及給藥 適應性喂養1周后,將30只SPF級雄性Balb/c小鼠隨機分為正常組、模型組、黃芪組,每組10只。正常組和模型組小鼠每天灌胃生理鹽水,黃芪組小鼠每天灌胃黃芪水煎液,持續14 d。第15天,除正常組外,其余各組小鼠均給予5Gy X射線一次性全身照射,

1.3 檢測指標

1.3.1 外周血細胞檢測 先用眼科剪把小鼠的胡須剪干凈,防止血液從胡須處留下引起溶血,影響檢測結果。左手拇指按壓小鼠眼部皮膚,使眼球突出,然后用彎頭鑷子迅速摘眼球,使血液從眼眶內流入EDTA-K2抗凝管中,全自動血液細胞分析儀檢測血細胞。

1.3.2 取胸腺和脾臟并計算脾臟和胸腺指數 取材前稱取小鼠體質量。摘眼球取全血后,頸椎脫臼處死小鼠,左手持彎頭鑷子夾起小鼠腹中線左側皮膚,右手持眼科剪從小鼠雙后肢連線的中點剪至頸部。取出胸腺和脾臟,用濾紙吸干殘血并稱重,分別計算小鼠胸腺和脾臟指數。

1.3.3 脾臟HE病理切片的制備 ①用4%多聚甲醛固定小鼠脾臟24～48 h;②酒精由低濃度到高濃度逐級脫水,然后用透明劑二甲苯透明,用石蠟置換組織塊中二甲苯透明劑,用熔點為52～60 ℃的石蠟進行包埋;③組織切片的厚度為5 μm;④經蘇木精-伊紅(HE)染色等步驟后,觀察脾臟組織結構變化。

2 結果

2.1 照射后各組小鼠外周血細胞變化情況 照射后8 d,與正常組比較,模型組小鼠外周血WBC、RBC、HGB、PLT顯著降低,差異均具有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,黃芪組小鼠外周血WBC、RBC、HGB顯著升高,差異具有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,黃芪組小鼠外周血PLT未明顯升高,差異無統計學意義(P>0.05),結果見表1。

表1 照后8 d各組小鼠外周血細胞計數的比較

2.2 照射后各組小鼠脾臟、胸腺變化情況 照射后8 d,與正常組比較,模型組、黃芪組小鼠脾臟指數、胸腺指數顯著降低,差異均具有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較,黃芪組小鼠脾臟指數、胸腺指數未明顯升高,差異具無統計學意義(P>0.05),結果見表2。

表2 照后8 d各組小鼠脾臟、胸腺指數比較

2.3 照射后各組小鼠脾臟形態學變化 照射后8 d,正常組小鼠脾臟紅、白髓分界清楚,淋巴細胞豐富。模型組小鼠紅、白髓分界不清,紅髓充血,白髓淋巴細胞結構紊亂。黃芪組小鼠脾臟紅、白髓分界尚可,凋亡淋巴細胞減少,紅髓未見明顯充血,結果見圖1。

圖1 照射后8 d小鼠脾臟病理切片圖(HE染色,×50)

3 討論

本實驗結果表明,模型組小鼠的紅細胞和血紅蛋白與正常組相比顯著下降(P<0.05),給藥組小鼠的紅細胞和血紅蛋白與模型組相比顯著升高(P<0.05)。說明5Gy X射線對Balb/c雄性小鼠的紅細胞和血紅蛋白均造成損傷,黃芪具有預防輻射損傷小鼠的紅細胞和血紅蛋白減少的作用。APS能使紅細胞表面C3受體數量增加,紅細胞的免疫水平增強[8]。

淋巴細胞是白細胞的主要組成成分,在Balb/c小鼠的外周血中,淋巴細胞約占白細胞的83%,是構成其免疫防御系統的要素之一[9]。對電離輻射最敏感的靶器官是細胞核,白細胞和淋巴細胞都有細胞核,對輻射極其敏感,輻射小鼠的白細胞和淋巴細胞急劇減少[10]。本實驗結果表明,模型組小鼠的白細胞與正常組相比急劇下降(P<0.05);給藥組小鼠的白細胞與模型組相比顯著升高(P<0.05)。說明5Gy X射線對Balb/c雄性小鼠的白細胞造成損傷,中藥黃芪具有預防輻射損傷小鼠的白細胞減少的作用。尹偉等[11]研究表明,APS可以協助紅細胞對淋巴細胞的免疫調控作用,引起淋巴細胞數量增加和增殖功能增強。

血小板是血液中最小的細胞,但其止血的作用極為重要。血小板在血栓栓塞、炎癥和免疫調節過程中起著關鍵作用[12]。本實驗結果表明,與正常組相比,模型組小鼠的血小板顯著下降(P<0.05);與模型組相比,給藥組小鼠的血小板未見明顯升高(P>0.05)。說明5Gy X射線對Balb/c雄性小鼠的血小板造成損傷,中藥黃芪具有預防輻射損傷小鼠血小板減少的作用不明顯。可能與血小板生存周期有關。

本實驗結果表明,與正常組相比,模型組小鼠的脾臟、胸腺指數顯著下降(P<0.05);與模型組相比,給藥組小鼠的胸腺、脾臟指數未明顯升高(P>0.05)。說明5Gy X射線對Balb/c雄性小鼠的胸腺、脾臟均造成損傷,中藥黃芪對輻射小鼠的胸腺、脾臟的預防作用不明顯。盧煒等[13]給予APS灌胃小鼠持續14 d。結果顯示,黃芪多糖顯著增大胸腺和脾臟指數。以上實驗結果說明,APS可通過提高胸腺和脾臟指數來發揮免疫調節作用。

研究認為電離輻射是一種毒邪,故命名為電離毒,中醫屬“火熱毒邪”范疇[14]。火為陽邪,煎熬津液,日久形成病理產物淤血,血液減少,進而導致紅細胞、白細胞、血紅蛋白、血小板等減少。火易耗氣傷津,血液由脾臟運化的水谷和津液經心陽赤化而成,津液減少,血液生成不足,進而導致外周血細胞減少。總之,電離輻射導致生物體的氣血津液俱虛,陰陽平衡失調。《醫林改錯》曰：“有形之血不能速生,無形之氣所當急固”。比如：亡血證指血液大量亡失之證。病因可因誤汗、誤下等錯誤治療導致氣血虧損,亦可由于吐血、便血、尿血、婦人下血等失血量過多或久病不愈轉化而來。由于陰陽互相依存,陰液耗傷過度,陽氣失其所依而散越,患者出現虛脫的癥狀。病機主要分為營血不足與氣血兩虛兩種。遵循急則治其標,緩則治其本的原則。針對急性失血患者,宜用大劑量的補氣藥。一方面可以固攝血液,防止出血;另一方面,氣能生血,使陽氣有所依附,防止虛陽外越。本實驗Balb/c雄性小鼠受輻射后,外周血液急劇下降。據以上中醫基礎理論,選用“補藥之長”的黃芪用于預防輻射損傷小鼠的白細胞、紅細胞、血紅蛋白等減少和脾臟、胸腺的損傷。