歸芪益元膏對力竭游泳法所致氣虛模型小鼠的影響

蘇苗，馬若飛，李金田，2，梁建慶，魏舒暢

（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院1，敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化教育部重點實驗室2，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院3，藥學(xué)院4，甘肅 蘭州 730000）

氣虛為中醫(yī)常見的名詞術(shù)語，一般表現(xiàn)為形體消瘦、無力、少氣、面色淡白、大便溏薄[1]等現(xiàn)象，是中醫(yī)臨床常見的證候。針對氣虛癥狀，臨床多用四君子湯等藥物治療，也有用西藥進行治療，但是運用西藥具有一定的局限性，無法完全治療氣虛證癥狀。歸芪益元膏由黃芪、當(dāng)歸、人參、枸杞子、熟地黃、五味子、麥冬、蜂蜜組成。黃芪、人參補氣作用顯著，氣能生血，血能載氣，當(dāng)歸、枸杞子等補血作用顯著，共用可氣血雙補，對氣虛小鼠具有改善作用。歸芪益元膏在臨床上常用于氣陰兩虛和氣血兩虛證，但關(guān)于氣虛、血虛的基礎(chǔ)研究較少?；诖?，本研究采用已成熟的氣虛模型建立方法-負重力竭游泳法建立氣虛模型小鼠。研究歸芪益元膏對氣虛小鼠氣虛證的改善作用，旨在為歸芪益元膏的藥理作用及機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物 昆明種（KM）小鼠，SPF 級，6～8 周齡，體重18～22 g，雌雄各半，共50 只。由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物編號：2021-192。

1.2 藥品與試劑 歸芪益元膏（蘭州和盛堂制藥有限公司，生產(chǎn)批號：20200901），歸芪益元膏由黃芪、當(dāng)歸、人參、熟地黃、五味子、蜂蜜等組成；本品為棕褐色稠厚半流體，具處方藥香氣，味甜，微酸；每毫升含蜂蜜藥膏相當(dāng)于生藥0.767 g,每毫升提取濃縮液相當(dāng)于生藥1.66 g。根據(jù)成人臨床劑量0.329 g/（kg·d）按體表系數(shù)換算為等效劑量，歸芪益元膏低、中、高劑量組分別為臨床給藥量的5、10、20 倍。腎上腺素、去甲腎上腺素試劑盒（批號：2109M31）；肝糖原、肌糖原試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：A043-1-1）；T/B 細胞檢測試劑盒（批號：A10913）。

1.3 儀器 ADVIA 2120/2120i（Siemens）全自動血液分析儀[西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品（上海）有限公司]；BD流式細胞儀（BD FACSCelestaTMFlow Cytometer）（SN:R66034400286）；采血管（生產(chǎn)批號：200711）。

1.4 藥品制備 按照規(guī)定的劑量稱取藥材，以水為溶劑萃取2 次，首次、第2 次分別為中藥材總劑量的8倍和6 倍，每次提取時長2 h。將每次提取的藥物溶液合并，用300 目濾布過濾，將濾液減壓濃縮后，加入制劑輔料，制備為膏劑[2]。

1.5 氣虛小鼠模型建立 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)4 d 后隨機分為5 組，每組10 只，稱取體重并記錄。除空白組外，其余各組每天在水溫20 ℃、水深35 cm 的水迷宮中行負重游泳試驗，于小鼠尾根部纏繞重量為該小鼠體重10%的保險絲，保證小鼠在水中不能用尾巴接觸底部。以力竭為度，即小鼠四肢劃動無力，身體豎立，鼻尖浸入水中5 s 不能自行浮出水面為力竭。立即將小鼠撈出，用干燥毛巾擦干鼠身。記錄小鼠力竭游泳時間，1 次/d，持續(xù)30 d。模型組、空白組每天灌胃等量蒸餾水。給藥量為0.2 ml/10 g。造模與給藥同時進行，連續(xù)給藥30 d，根據(jù)體重變化情況調(diào)整給藥量，每天定時給藥。

1.6 實驗動物分組、給藥及取材 將50 只小鼠隨機分為空白組、模型組、歸芪益元膏低、中、高劑量組。實驗開始每天給予空白組和模型組灌胃等體積蒸餾水，歸芪益元膏低劑量組給藥歸芪益元膏1.6 g/kg，中劑量組給藥歸芪益元膏3.3 g/kg，高劑量組給藥歸芪益元膏6.6 g/kg。給藥量為0.1 ml/10 g。連續(xù)給藥30 d，給藥期間記錄小鼠體重及體征變化。末次給藥24 h 后股動脈取血加入EDTA 采血管中，全血采用全自動血液分析儀檢測其外周血象中紅細胞（RBC）、血小板（PLT）、白細胞（WBC）、血紅蛋白（Hb）等。取脾臟、胸腺，分別稱重計算脾臟指數(shù)（spleen index，SI）、胸腺指數(shù)（thymus index，TI）。取肝臟及肌肉組織，進行肝糖原、肌糖原的測定；取腎、腎上腺組織進行去甲腎上腺素及腎上腺素的測定。

1.7 證候?qū)W觀察 給藥及造模過程中，每3 天記錄1次小鼠體重，并以小鼠耳緣、鼻唇顏色，皮毛狀態(tài)，以及飲食，運動情況等作為證候?qū)W觀察指標(biāo)。

1.8 外周血象指標(biāo)的檢測[3]取全血采用全自動血液分析儀檢測其外周血象中紅細胞（RBC）、血小板（PLT）、白細胞（WBC）、血紅蛋白（Hb）等。

1.9 力竭游泳時間記錄[4]每天在水溫20 ℃、水深35 cm 的水迷宮中行負重游泳試驗，于小鼠尾根部纏繞重量為該小鼠體重10%的保險絲，保證小鼠在水中不能用尾巴接觸箱底，以力竭為度（小鼠四肢劃動無力，身體豎立，整個頭部浸入水中5 s 不能自行浮出水面），立即將小鼠撈出，用干燥毛巾擦干鼠身，記錄小鼠力竭游泳時間。

1.10 腎上腺素與去甲腎上腺素含量[5]實驗結(jié)束后取材，用10%氨基甲酰乙酯（1 g/kg 或10 ml/kg 體重）經(jīng)腹腔注射麻醉，迅速分離小鼠全腦，去除小腦及腦干后勻漿，4 ℃、3000 r/min 離心10 min，放置-20 ℃冰箱保存，采用ELISA 試劑盒測定小鼠腦內(nèi)腎上腺素和去甲腎上腺素的含量。

1.11 免疫功能檢測[6]利用細胞流式儀檢測脾臟T細胞亞群（CD3+、CD4+、CD8+）與B 細胞（CD19+）。取小鼠脾臟研磨過100 目篩，PBS 5 ml 沖洗，收集分離的脾細胞懸液，于1000 r/min，4 ℃條件下離心5 min，棄上清；加紅細胞裂解液Tris-NH4Cl 3 ml，混勻脾細胞，靜置10 min，加1 ml PBS 終止裂解，于1000 r/min，4 ℃條件下離心5 min，取下面白色細胞，PBS 洗2 遍，重懸細胞，計數(shù)調(diào)整細胞濃度為1∶107/ml，進行流式細胞術(shù)檢測樣品T 細胞亞群與B細胞。

1.12 肝糖原、肌糖原測定[7]采用蒽酮比色法測肝糖原、肌糖原含量。造模后，為保證實驗平行性，各組老鼠分批同時進行取材。用10%氨基甲酰乙酯（1 g/kg 或10 ml/kg 體重）經(jīng)腹腔注射麻醉，取其肝組織和后肢肌肉各200 mg，制成10%的組織勻漿，以3000 r/min 離心5 min，取上清液以蒽酮比色法測定肝糖原和肌糖原含量。

1.13 胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)[8]小鼠取血后處死，取胸腺、脾臟稱重，以mg/g 單位計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。脾臟指數(shù)（SI）=脾臟質(zhì)量（mg）/體重（g）；胸腺指數(shù)（TI）=胸腺質(zhì)量（mg）/體重（g）。

1.14 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行組間方差分析處理。符合正態(tài)分布且方差齊時采用Oneway ANOVA 單因素方差分析，方差不齊則采用非參數(shù)檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01 為統(tǒng)計學(xué)意義顯著。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠外周血象指標(biāo)的變化 與空白組比較，模型組中RBC、PLT、WBC、Hb 等含量顯著降低（P＜0.01）；模型組外周血含量降低，提示其氣虛模型的建立；與模型組比較，歸芪益元膏低、中、高各組中RBC、PLT、WBC、Hb 含量升高（P＜0.05），見表1。

表1 藥物對小鼠外周血象的影響（，n=10）

表1 藥物對小鼠外周血象的影響（，n=10）

注：與空白組比較，*P＜0.05；**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

2.2 各組小鼠力竭游泳時間比較 與空白組比較，模型組小鼠力竭游泳時間縮短（P＜0.05）；與模型組比較，歸芪益元膏高、中、低劑量組小鼠力竭游泳時間增加（P＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠力竭游泳時間比較（，min）

表2 各組小鼠力竭游泳時間比較（，min）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

2.3 歸芪益元膏對氣虛小鼠腎上腺素與去甲腎上腺素含量的影響 與空白組比較，模型組小鼠腎上腺素及去甲腎上腺素濃度均有所降低（P＜0.01）；與模型組比較，歸芪益元膏高、中劑量組腎上腺素及去甲腎上腺素濃度均有明顯升高（P＜0.01），見表3。

表3 藥物對小鼠腎上腺素和去甲腎上腺素的影響（，pg/ml）

表3 藥物對小鼠腎上腺素和去甲腎上腺素的影響（，pg/ml）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01

2.4 歸芪益元膏對氣虛小鼠免疫細胞的影響 與空白組比較，模型組B 細胞、T 淋巴細胞亞群CD4+、CD8+水平均降低（P＜0.01）；與模型組比較，歸芪益元膏高劑量組T 淋巴細胞亞群CD4+、CD8+水平均顯著升高（P＜0.01），見圖1。

圖1 藥物對小鼠B 細胞及T 細胞亞群CD4+、CD8+的影響

2.5 歸芪益元膏對氣虛小鼠肝糖原與肌糖原含量的影響 與空白組比較，模型組小鼠肝糖原、肌糖原含量顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，歸芪益元膏高、中、低劑量組大鼠肝糖原、肌糖原含量顯著增加（P＜0.01），其歸芪益元膏高劑量組效果最為顯著，見圖2、表5。

圖2 藥物對小鼠肝糖原、肌糖原的影響

表5 藥物對小鼠肝糖原和肌糖原的影響（，mg/g）

表5 藥物對小鼠肝糖原和肌糖原的影響（，mg/g）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01

2.6 歸芪益元膏對氣虛小鼠胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)的影響 與空白組比較，模型組脾臟、胸腺明顯萎縮，脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，歸芪益元膏高、中、低劑量組可升高脾臟及胸腺指數(shù)（P＜0.05），見表6。

表6 藥物對小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響（）

表6 藥物對小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響（）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

3 討論

氣虛證是一類以神疲乏力、少氣懶言、聲低息弱、自汗、動則加劇等為臨床表現(xiàn)的虛弱證候[9]，是中醫(yī)辨證論治理論體系中最重要的證候之一，其發(fā)病機制主要是元氣不足，導(dǎo)致氣的推動、溫煦等基本功能或臟腑組織功能活動減退。氣虛證在多數(shù)情況下僅表現(xiàn)為一些癥狀，而這些癥狀常不足以診斷為某一特定的疾病[10]。實驗動物模型難以集中復(fù)制臨床氣虛各種癥狀與體征，僅能對氣虛證部分特征性變化予以模擬重現(xiàn)。氣虛證的動物模型主要有限制日攝食量法、瀉下法、疲勞法、煙熏法等制備氣虛老鼠模型。氣虛最直接和客觀的表現(xiàn)是疲勞、運動耐力、免疫力下降，而力竭游泳時間是反映運動耐力的重要指標(biāo)[11]。所以本實驗采用力竭游泳時間法制備氣虛小鼠模型。

歸芪益元膏由黃芪、當(dāng)歸、人參、熟地黃、五味子、蜂蜜等組成，黃芪是一味健脾益氣、扶正固本的要藥，在臨床中應(yīng)用廣泛，常用于治療氣虛自汗、盜汗、浮腫、痛疽不潰或潰久不斂、脾虛泄瀉及各種氣衰血虛之癥[12]。歸芪益元膏中黃芪、當(dāng)歸為主，黃芪、當(dāng)歸配伍有助于調(diào)節(jié)物質(zhì)能量代謝，調(diào)節(jié)免疫功能，發(fā)揮益氣補血功用。人參更是具有大補元氣之功效，諸藥合用具有補氣之用。

在現(xiàn)代氣虛證候模型研究中，動物皮毛色澤、精神狀態(tài)、活動情況、體質(zhì)量變化、攝食飲水改變等是評價氣虛動物模型的基本體表要素[13]。一般行為體征可粗略評價補氣效果。本研究通過對小鼠證候?qū)W觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組與空白組比較，體重下降，口唇、爪、甲顏色淡白，易脫毛，身體毛發(fā)少澤蓬松、呈淡黃色，倦怠易團縮，從中醫(yī)學(xué)理論分析其證候以氣虛證為主。歸芪益元膏各組與模型組比較，其精神狀態(tài)較好，爪甲紅潤，毛發(fā)柔順，提示歸芪益元膏具有補氣的作用，能改善其證候?qū)W特征。

氣能生血，血能載氣，氣能生血，是指血的組成及其生成過程中，均離不開氣和氣的運動變化（氣化功能）。所以對于氣虛小鼠，氣虛則運化功能失常，則會導(dǎo)致血的運行也受到影響，血虛一定程度上則可反應(yīng)氣虛程度。研究顯示[14]，氣虛SD 大鼠在高、中及低切變率下全血黏度和血漿黏度高于正常組。結(jié)合患者情況，血液學(xué)指標(biāo)會有不同表現(xiàn)，如婦科腹腔鏡術(shù)后氣虛證出現(xiàn)白細胞、中性粒細胞百分比升高,紅細胞、血紅蛋白、紅細胞比容、血小板計數(shù)、總蛋白、白蛋白下降，紅細胞沉降率明顯加快。本實驗進行血常規(guī)的檢測，結(jié)果顯示力竭游泳所致氣虛模型組與空白組比較，RBC、PLT、WBC、Hb 含量均降低，與模型組相比較，歸芪益元膏高、中、低劑量組可使力竭游泳所致氣虛動物模型的RBC、PLT、WBC、Hb 升高。

《素問·舉痛論》：“驚則心無所倚，神無所歸，慮無所定，故氣亂矣。勞則喘息汗出，外內(nèi)皆越，故氣耗矣”，對于氣虛模型小鼠，力竭游泳時間是反映運動耐力的重要指標(biāo)[15]。實驗結(jié)果顯示模型組小鼠與空白組比較游泳時間明顯縮短，歸芪益元膏組游泳時間與模型組相比較時間明顯延長，證明力竭游泳法制備氣虛模型小鼠成功，歸芪益元膏組對氣虛小鼠具有一定的補益作用，可改善小鼠氣虛癥狀。

氣虛則機體免疫功能下降，而胸腺、脾與機體的免疫功能密切相關(guān)。作為重要的外周免疫器官，胸腺和脾是T、B 淋巴細胞成熟、分化及免疫應(yīng)答的重要場所，其體積大小是評價機體非特異性免疫的重要指標(biāo)[16]。脾T 淋巴細胞亞群CD3+和CD4+主管細胞免疫，具有抗病毒和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能的作用[17]。本實驗采用流式細胞儀檢測小鼠免疫細胞CD4+、CD8+細胞水平，對小鼠的脾臟、胸腺進行稱重記錄，計算其脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)。本實驗結(jié)果表明，與空白組比較，模型組脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)均顯著降低，B 細胞、T 淋巴細胞亞群CD4+、CD8+水平均顯著降低；與模型組比較，歸芪益元膏高劑量組T 淋巴細胞亞群CD4+、CD8+水平均顯著升高，歸芪益元膏高、中、低劑量組脾臟指數(shù)明顯升高，中、高劑量組胸腺指數(shù)明顯升高，表明歸芪益元膏對氣虛小鼠的免疫功能具有一定的調(diào)節(jié)作用，且高、中劑量組效果更佳。

糖原是生物體內(nèi)能源的一種貯存形式。動物體內(nèi)的能量儲備包括直接能源物質(zhì)（如血糖、肝糖原、肌糖原）和間接能源物質(zhì)（如脂肪）等，動物以脂肪的形式儲存能量可以間接作為基礎(chǔ)代謝的能量來源[18]。在長時間大強度運動中，運動前肌糖原的儲量決定達到力竭的時間，直接影響耐力訓(xùn)練和比賽的運動能力[19]。所以肝糖原、肌糖原的測定可以明顯的看出小鼠的力竭程度及反應(yīng)氣虛癥狀。本實驗結(jié)果表明，歸芪益元膏高、中、低劑量組大鼠肝糖原、肌糖原含量顯著增加，其歸芪益元膏高劑量組效果最為顯著，說明歸芪益元膏對氣虛小鼠肝糖原、肌糖原具有一定的調(diào)節(jié)作用，可調(diào)節(jié)其基礎(chǔ)代謝等。

去甲腎上腺素和腎上腺素屬于兒茶酚胺類物質(zhì)，是由腎上腺髓質(zhì)分泌的一類重要的神經(jīng)遞質(zhì)與激素，對人體多個系統(tǒng)功能的調(diào)控起重要作用。氣虛則會無力運化，造成全身機能的低下，實驗結(jié)果表明其模型組小鼠精神狀態(tài)較差，腎上腺素及去甲腎上腺素濃度值均較低，而歸芪益元膏組則有所升高，證明其具有補益作用，可調(diào)節(jié)全身氣化功能。

綜上所述，歸芪益元膏可以明顯改善力竭游泳所致氣虛小鼠的運化及免疫功能。本研究從藥理學(xué)角度探討歸芪益元膏的補氣作用，為其臨床應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。