HMMR 基因在結(jié)腸癌中的表達及其對患者預(yù)后的影響

陳雨，盧業(yè)才

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院胃腸外科，安徽 巢湖 238000）

惡性腫瘤是困擾全人類健康的重要疾病之一，結(jié)直腸癌（colorectal cancer）是胃腸道常見的惡性腫瘤之一，我國以41～65 歲人群發(fā)病率較高。近20 年來，結(jié)直腸癌的發(fā)病率明顯上升[2]。隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快，人們暴露于各種致癌因素的機會較前大大增加。針對結(jié)腸癌的治療方法包括手術(shù)、化療[1，2]等多方法。本研究通過信息生物學(xué)的方法，挖掘透明質(zhì)酸介導(dǎo)運動因子受體基因（HMMR 基因）表達產(chǎn)物在結(jié)腸癌組織中的表達情況，分析HMMR 基因表達與結(jié)腸癌患者預(yù)后生存的關(guān)系，以期為結(jié)腸癌的診斷及治療提供新的思路和方向。

1 資料與方法

1.1 資料來源 從基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（GEO）下載（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE140973）結(jié)直腸癌基因表達譜，使用數(shù)據(jù)集GSE140973 篩選差異表達基因（DEGs），該基因樣本包含114 個樣本，共檢測44 495 個基因數(shù)據(jù)，使用R 軟件的“l(fā)imma”軟件包預(yù)設(shè)篩選標準，選擇P＜0.05和|Log2fold change（FC）|＞1 作為截止標準，進行DEGs 的篩選。通過上述方法篩選兩組樣本之間的差異表達基因。

1.2 功能和途徑富集分析 使用DAVID 據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）[3]對DEGs 進行富集分析，設(shè)置標準FDR＜0.05 進行GO 分析和KEGG 分析，通過GO 分析和KEGG 通路分析進行可視化研究。

1.3 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用搜索工具檢索交互基因數(shù)據(jù)庫（http://www.string-db.org/）評估PPI 信息。此外，為了評估DEGs 之間的相互關(guān)系，使用字符串數(shù)據(jù)庫進行分析，并使用Cytoscape 軟件進行可視化[4]。

1.4 獲取Hub 基因并對其進行進一步驗證 使用插件cytoHubba 在Cytoscape 中選擇PPI 網(wǎng)絡(luò)的中心模塊[5]。設(shè)置參數(shù)：Hubba nodes:Top 10 nodes ranked by DMNC，獲取具有高度連通性的前10 個DEGs，將其作為結(jié)直腸癌的Hub 基因。GEPIA 數(shù)據(jù)庫是一個基于TCGA 的在線分析數(shù)據(jù)庫，設(shè)置參數(shù)：P≤0.01，癌癥組織為結(jié)腸癌，|Log2FC| Cutoff=1，Jitter Size＝0.4，進行差異表達分析；生存分析設(shè)置參數(shù)：Group Cutoff=Median，95% Confidence Interval=yes，Cutoff-High（%）=50，Cutoff-Low（%）=50，組織為結(jié)腸癌組織，獲得的Hub 基因通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫進行生存分析和基因差異表達分析驗證。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織中 DEGs 的鑒定 通過GSE140973 數(shù)據(jù)集確定了807 個DEGs，其中653個上調(diào)，154 個下調(diào)，見圖1。

圖1 結(jié)直腸癌組織的DEGs

2.2 DEGs 的GO 分析和KEGG 分析 GO 分析結(jié)果顯示，DEGs 的生物過程（BP）主要富集在糖酵解過程、典型糖酵解、細胞分裂、有絲分裂核分裂、姐妹染色單體粘連、染色體分離、染色體組織、有絲分裂細胞周期的G1/S 轉(zhuǎn)換及對藥物的反應(yīng)方面，見圖2A。DEGs 的分子功能（MF）主要富集在蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP 結(jié)合血小板衍化等方面，見圖2B。DEGs 的細胞成分（CC）主要富集在染色體著絲粒區(qū)、胞漿、濃縮染色體動粒、細胞外間隙、細胞膜、細胞外基質(zhì)部位，見圖2C。KEGG 分析顯示，DEGs 主要富集在糖酵解/糖異生、果糖和甘露糖代謝、細胞周期、HIF-1 信號通路、碳代謝、癌癥的中樞碳代謝、抗生素的生物合成、卵母細胞減數(shù)分裂、半乳糖代謝中，見圖2D。

圖2 DEGs 的GO 分析和KEGG 分析（續(xù)）

圖2 DEGs 的GO 分析和KEGG 分析

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及Hub 基因獲取 DEGs 的PPI 網(wǎng)絡(luò)由354 個節(jié)點和5662 個邊緣組成，包括653 個上調(diào)基因和154 個下調(diào)基因。具有高度連通性的前10個DEGs 是結(jié)直腸癌的Hub 基因（HMMR、SHCBP1、ERCC6L、ZWINT、FAM83D、CDCA2、SPC25、SKA1、KIAA0101、MND1），它們可能在腫瘤發(fā)生和增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用，見圖3。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.4 生存分析和差異表達分析 根據(jù)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果基因，將其上傳至GEPIA 數(shù)據(jù)庫，對其進行生存分析和預(yù)后分析，通過數(shù)據(jù)庫獲得HMMR 基因在差異分析和生存分析中均有意義，見圖4。

圖4 生存和差異表達分析

3 討論

結(jié)直腸癌是一種生物學(xué)異質(zhì)性疾病，大約70%的結(jié)直腸癌是由腺瘤性息肉演變而來，從形態(tài)學(xué)上可見到增生、腺瘤及癌變各階段以及相應(yīng)的染色體改變，耗時10～15 年，但也有約30%的癌不經(jīng)腺瘤演變直接以癌巢的形式出現(xiàn)[6]。隨分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，結(jié)直腸癌癌變過程中的基因改變逐漸被認識，已知結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多階段及多基因參與的細胞遺傳性疾病。因此，了解其分子機制對于更好地診斷和治療結(jié)直腸癌至關(guān)重要。

本研究結(jié)果表明，結(jié)腸癌組織中有807 個基因的表達發(fā)生了改變。在807 個DEGs 中，653 個上調(diào)，154 個下調(diào)。進行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，以確定與結(jié)直腸癌臨床特征相關(guān)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和基因共表達模塊。此外，還進行了功能和途徑分析，以發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌相關(guān)的生物過程和途徑。通過對DEGs 的GO 分析、KEGG 分析，并對DEGs 進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析獲取Hub 基因，并對Hub 基因進行生存分析和差異分析，得知HMMR 基因在結(jié)腸癌中高表達，HMMR 基因的高表達對結(jié)腸癌患者的生存具有影響。

HMMR 基因位于人類五號染色體，HMMR 首先被確定為從鼠細胞上清液中純化的新型透明質(zhì)酸受體復(fù)合物的成分，HMMR 基因編碼的透明質(zhì)酸介導(dǎo)運動因子受體蛋白參與細胞運動，其在乳腺組織中表達，并與其他蛋白質(zhì)一起與BRCA1 和BRCA2 形成復(fù)合物。目前已經(jīng)證實HMMR 基因的表達與乳腺癌風險相關(guān)[7]。同時有研究表明HMMR 基因表達與肺癌和肝癌相關(guān)[8，9]。透明質(zhì)酸是一種細胞外基質(zhì)成分，可吸收組織中的水分并與細胞表面受體[如分化簇44（CD44）]結(jié)合以促進細胞生長和運動[10]。HMMR 可定位蛋白質(zhì)復(fù)合物以增強有絲分裂激酶（如Polo 樣激酶1 和極光激酶A）的活性，并控制動力蛋白和驅(qū)動蛋白的運動活動，HMMR 的結(jié)構(gòu)是一種卷曲螺旋微管相關(guān)蛋白，它可以通過其N 端直接與微管結(jié)合，并通過其C 端BZIP 序列定位到中心體[11]。HMMR 作為紡錘體組裝因子（如TPX2、DYNLL1 和CHICA/FAM83D）的結(jié)合伙伴，在有絲分裂和減數(shù)分裂過程中調(diào)節(jié)紡錘體微管的組裝、穩(wěn)定性和定位。在有絲分裂之前和期間，細胞中HMMR 的表達升高，而可檢測到HMMR 表達的組織往往高度增殖。目前已經(jīng)證實HMMR 基因是乳腺癌的易感基因。HMMR 在結(jié)構(gòu)上與C 端BZIP 序列非常相似在Xklp2 中，它可以與TPX2 進行交互[12]。TPX2 是一種微管相關(guān)蛋白，由位于人類染色體帶20q11.1 的基因編碼。它是哺乳動物細胞動粒處微管形成所必需的，TPX2 位于Ran-GTP 的下游，在紡錘體形成中起著核心作用[13，14]。在有絲分裂的早期階段，TPX2 以依賴Ran-GTP 的方式釋放，TPX2表達在細胞周期階段受到嚴格調(diào)控，在G1～S 轉(zhuǎn)運時可檢測到，并在胞質(zhì)分裂完成時消失，TPX2 在結(jié)腸癌組織和細胞系中的高表達[15]，抑制TPX2 表達會使PI3K/AKT 信號通路失活并降低結(jié)腸癌細胞的致瘤性[16]。PI3K-AKT-mTOR 信號通路控制多種細胞過程，包括代謝、運動、增殖、生長和存活，是人類癌癥中最常見的失調(diào)通路之一[17，18]。

在HMMR 沉默的細胞中，抑制性TPX2-Eg5 復(fù)合物降低，目前已知這些復(fù)合物會抑制Eg5 活性，干擾TPX2 和Eg5 附近紡錘極之間的共定位[19]。HMMR 能夠調(diào)節(jié)非有絲分裂細胞中的TPX2 的定位[20]。其中HMMR 通過BZIP 序列將TPX2 定位在微管負端附近，這使得TPX2-Eg5 復(fù)合物形成。需要HMMR 介導(dǎo)的Eg5 活性調(diào)節(jié)來穩(wěn)定雙極紡錘體并促進動粒-微管附著，這是細胞分裂進入后期和染色體分離所必需的，這也突出了非運動銜接蛋白在調(diào)節(jié)運動活動和維持基因組穩(wěn)定性方面的重要性。已知TPX2 在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[21，22]，而本次研究發(fā)現(xiàn)HMMR 在結(jié)腸癌的診斷和預(yù)后分析方面有重要作用，TPX2 和HMMR 可在細胞內(nèi)形成交互作用，而TPX2 表達會影響PI3K/AKT信號通路進而影響結(jié)腸癌細胞的致瘤性，因此預(yù)測HMMR 基因的表達對結(jié)腸癌的影響是通過PI3K/AKT 信號發(fā)揮作用的。

綜上所述，HMMR 基因在結(jié)腸癌中表達上升，且HMMR 基因的高表達和結(jié)腸癌患者的預(yù)后相關(guān)，HMMR 基因表達能夠延長結(jié)腸癌患者的生存時間。