以AFP升高為主要表現的成人Wilson病的臨床和遺傳學特征

李旋 黃燕 趙衛峰 楊永峰 甘建和

肝豆狀核變性 (hepatolenticular degeneration,HLD)又名 Wilson病 (WD),是一種常染色體隱性遺傳的單基因、可治性疾病,致病基因 ATP7B定位于染色體 13q14,3,編碼一種銅轉運P型ATP酶[1,2]。ATP7B基因缺陷導致銅代謝障礙,銅在身體多處沉積,以肝臟和大腦最明顯。流行病學資料顯示WD在世界范圍發病率為1/3萬～1/10萬,我國發病率高達6/10萬,其致病基因攜帶率約為1/90[3,4]。WD好發于青少年,男比女稍多。現報道1例無明顯臨床癥狀、僅出現以AFP升高為主要表現的成人肝豆狀核變性的臨床特點,分析ATP7B基因突變的遺傳學,為該病的診斷和治療提供參考。

資料與方法

一、研究對象

中年女性,49歲,因AFP升高2月余,僅上腹部輕微不適就診。無黃疸及其他特殊不適。2018年6月10日查AFP 95.82 ng/mL,ALT 73.51 U/L, AST 63.07 U/L, GGT 200.43 U/L。胃鏡示膽汁反流性胃炎。保肝降酶、隨訪觀察。2018年8月3日查AFP 97.47 ng/mL。肝炎病毒全套陰性。抗核抗體+自身免疫肝病抗體全套陰性。腹部MRI平掃: 肝硬化伴多發再生結節。MRCP:未見明顯異常。2018年8月14日查血常規: WBC 4.79×109/L, Hb 130 g/L, PLT 151×109/L。生化: TBil 19.28 μmol/L, ALT 105.9 U/L, AST 77.7 U/L, GGT 334.6 U/L, Alb 39.5 g/L, Glb 25 g/L,AFP 124.5 ng/mL。以肝硬化、肝細胞癌?收治入院。既往膽囊結石手術史10余年,否認病毒性肝炎、糖尿病、腎臟病、高血壓病史、飲酒史、長期藥物使用史、遺傳病史、有毒有害物質接觸史。體格檢查:血壓 112/60 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),BMI=20.81 kg/m2。TBil 23.9 μmol/L, ALT 103.6 U/L, AST 79.5 U/L, GGT 358.7 U/L, Alb 40.7 g/L, Glb 27.8 g/L, 血脂正常。AFP 163 ng/mL。凝血功能: PT 14.1 s, Fbg 1.76 g/L, INR 1.11。抗核抗體+自身免疫肝病抗體全套:陰性。CMV DNA+EBV DNA 陰性。2018年8月16日普美顯MRI+MRCP:肝硬化伴多發再生結節形成,MRCP未見明顯異常。患者出現AFP進行性升高,但無明顯腫瘤消耗癥狀,同時影像學檢查未見腫瘤表現。為進一步明確診斷于2018年8月21日肝組織穿刺病理活檢示:肝硬化伴肝細胞重度脂肪變性。結合臨床及病理高度懷疑肝豆狀核變性,隨后完善相關特異性檢查,銅藍蛋白 0.07 g/L(正常<200 mg/L);眼角膜K-F環:陰性;血清銅 381.6 μg/L(正常700～1400 μg/L);24 h尿銅含量 176.5 μg/24 h(正常15～60 μg/24 h);頭顱CT未見明顯異常。

二、研究方法

(一)臨床資料 收集患者臨床資料,包括一般資料、臨床表現、生化指標、影像學資料,肝組織病理資料,基因檢測結果等。

(二)外顯子捕獲測序 基因檢測有助于WD的早期診斷及治療。在獲得患者知情同意后,通過二代測序(NGS)技術篩查致病基因,以明確診斷。用EDTA抗凝管采集患者外周血2 mL。按照QIAamp DNA提取試劑盒說明書抽提患者基因組DNA,并建立含有與肝豆狀核變性相關基因的全基因組文庫,利用MiSeq測序儀(illumina Inc,USA)進行高通量測序。利用生物信息學軟件工具對測序數據進行基因序列分析,找出致病基因并且預測變異的致病性。

(三)突變前后的蛋白空間結構對比分析 用SWISS-MODEL構建ATP7B野生型和突變型蛋白序列所對應的蛋白三級結構模型,并比對模型間的構象差異,判斷基因突變對蛋白質結構和功能的影響。

結 果

一、MRI普美顯+MRCP結果

肝臟表面凹凸不平,肝左葉增大,T2WI肝臟內多發低信號結節,增強未見異常強化,普美顯延遲期未見明顯低信號。門脈主干及分支顯影正常,肝內外膽管未見擴張。腹膜后和腸系膜區未見腫大淋巴結。脾臟體積增大。肝硬化伴多發再生結節。見圖1。

圖1 MRI普美顯+MRCP影像學表現

二、肝活組織病理檢查結果

肝小葉結構中度紊亂,肝細胞輕中度濁腫伴點灶性壞死,肝細胞大泡性脂肪變性,肝細胞糖原性空泡核形成,玫瑰花結形成,匯管區輕中度擴大,炎性細胞浸潤,纖維組織增生,中度慢性肝炎G2-3,S1-2 伴部分自身免疫性肝炎。見圖2。

注:A為HE染色,4X; B為HE染色,4X; C為HE染色,10X

三、遺傳學分析結果

外顯子組捕獲測序在患者ATP7B基因檢測到兩個突變,分別是Exon15 c.3316G>A p.(Val1106Ile)和 Exon8 c.2333G>T p.(Arg778Leu)。見表1。

表1 基因分析結果

四、蛋白結構預測分析

通過對比正常堿基序列,并進一步采用SWISS-MODEL同源建模,構建預測蛋白質模型。見圖3、圖4。

注:p.(Arg778Leu)突變前后ATP7B蛋白結構飄帶圖,A為野生型ATP7B蛋白(Arg);B為突變型ATP7B蛋白(Leu)。p.(Val1106Ile)突變前后ATP7B蛋白結構飄帶圖;C為野生型ATP7B蛋白(Val);D為突變型ATP7B蛋白(Ile)

注:p.(Arg778Leu)突變前后 ATP7B蛋白空間結構預測圖,A為野生型 ATP7B蛋白結構模型;B為突變型ATP7B蛋白結構模型,第778位氨基酸由精氨酸(圖A)變為亮氨酸(圖B);C顯示突變后可能會影響a螺旋結構的穩定性,進而可能影響蛋白結構或者功能。p.(Val1106Ile)突變前后 ATP7B蛋白空間結構預測圖;D為野生型 ATP7B蛋白結構模型;E為突變型ATP7B蛋白結構模型,第1106位氨基酸殘基由纈氨酸(圖D)變為異亮氨酸(圖E);F顯示突變后的氨基酸與周圍氨基酸存在相互排斥,可能由此影響蛋白功能

五、治療及轉歸

基因檢測結果顯示存在ATP7B基因突變。根據WD的Leipzig評分系統為7分,最終診斷為Wilson病。給予青霉胺+葡萄糖酸鋅聯合治療后,效果確切,患者ALT、AST、AFP水平明顯下降,見圖5和圖6,并逐漸恢復至正常,肝纖維化程度亦下降,見圖7,患者肝功能得到好轉,病情穩定后出院。

圖5 患者治療前后ALT、AST變化

圖6 患者治療前后AFP變化

注:患者治療后經Fibroscan檢測,肝臟硬度值明顯下降,脂肪衰減值亦明顯下降

討 論

WD致病基因 ATP7B定位于染色體 13q14,3,編碼的銅轉運P型ATP酶參與銅的跨膜轉運,將銅離子轉運給銅藍蛋白前體以合成全銅藍蛋白,使銅離子能夠從肝細胞轉運至膽汁, 經膽道排出體外[5-7]。如果該酶功能缺陷,血清銅藍蛋白合成減少,銅離子經膽汁排出障礙,多余的銅沉積于肝臟, 并分泌入血,沉積在腦、腎、骨、角膜等器官組織,從而導致肝臟損傷、神經和精神系統異常、腎臟損傷、骨關節病,以及角膜K-F環等多種臨床表現。以肝臟或神經系統的損傷為主。肝病表現通常早于神經系統,臨床上可表現為無癥狀、急性肝炎、急性肝衰竭、慢性肝炎、肝硬化等多種形式[5]。肝臟損傷后,動員肝前體細胞增殖分化,此過程引起AFP的分泌。正常人血清中AFP<20 μg/L。肝細胞癌,活動性肝炎等都會導致AFP升高。AFP在肝臟慢性炎癥中的增高反映肝細胞炎癥、壞死和再生。在肝損傷患者中,AFP的數值常呈一過性升高,經保肝等治療后,AFP常能恢復正常。若AFP增高幅度過大,數值過高,應高度警惕原發性肝癌[8]。本例患者AFP雖較正常明顯升高,但無腫瘤消耗性表現,影像學不支持,病理未見腫瘤細胞,最新的AFP數據下降明顯,均不支持肝癌診斷,所以活動性肝炎可能性更高。其影像學和病理學均提示肝硬化表現,進而排查肝硬化的可能病因:患者女性,無飲酒史,排除酒精性脂肪肝;HV-M陰性,CMV+EBV 陰性,排除病毒性肝炎;無長期用藥及毒物接觸史,排除藥物或中毒性肝炎;無其他免疫相關疾病,多次查自免肝抗體陰性,排除自身免疫性肝病。患者體型瘦,BMI低,血糖、血脂、尿酸正常,臨床表現不明顯,排除了諸多肝硬化的病因,再結合肝細胞大泡性脂肪變性的病理結果,綜合考慮WD的可能性較大。隨后完善了WD相關特異性檢查(銅藍蛋白、眼角膜K-F環、血清銅、24h尿銅含量、頭顱CT等),并進行了基因檢測。基因分析結果顯示ATP7B基因突變c.3316G>A 和c.2333G>T的復合雜合子;蛋白結構預測分析顯示突變c.2333G>T是ATP7B蛋白的致病性突變。由于錯義突變,導致蛋白質的三級結構發生變化,氫鍵的位置和數量明顯改變,最終出現氨基酸的錯譯。ATP7B 基因 Exon8 c.2333G>T p.(Arg778Leu)錯義雜合突變,致2333位鳥嘌呤(G)突變為胸腺嘧啶(T)[9],致所編碼的蛋白質第778位氨基酸由精氨酸(Arg)變為亮氨酸(Leu)。文獻報道該變異降低了細胞內銅離子的外排作用,并影響ATP7B蛋白在細胞內的定位和運輸,綜合考慮,認為該變異為致病性變異。Exon15 c.3316G >A p.(Val1106 Ile)錯義雜合突變,致3316位鳥嘌呤(G)突變為腺嘌呤(A),致翻譯產物蛋白質第1106位氨基酸殘基由纈氨酸(Val)變為異亮氨酸(Ile)。Val1106位點雖位于保守序列,但屬于罕見的多態性位點,影響WD患者的表現度,也有研究顯示該變異對其功能無顯著影響。綜合考慮,該變異的臨床意義未明。有研究發現WD的基因型和表型存在一定的相關性,其中R778L突變可能與較早的發病年齡、低水平的血清銅藍蛋白有關,也可能與更嚴重的肝功能損傷有關[10,11]。本例患者存在R778L突變, 是肝豆狀核變性疾病的熱點之一。

綜上所述,本例WD患者以AFP升高為主要表現,其突變基因ATP7B(13q14) Exon15 c.3316G>A p.(Val1106Ile),ATP7B(13q14) Exon8 c.2333G>T p.(Arg778Leu)的發現為確診、治療以及家系遺傳咨詢提供了遺傳學依據。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。