基于中醫藥整合藥理學和轉錄組學探究丹梔逍遙散防治焦慮肝郁化火證的作用機制

潘賜明，任 雪，韋姍姍，曹蓓苓，王 維，楊 艷，陳文慧，徐宏喜

基于中醫藥整合藥理學和轉錄組學探究丹梔逍遙散防治焦慮肝郁化火證的作用機制

潘賜明1, 2，任 雪2, 3，韋姍姍1*，曹蓓苓1，王 維1，楊 艷1，陳文慧1，徐宏喜2

1. 云南中醫藥大學，云南 昆明 650500 2. 上海中醫藥大學，上海 201203 3. 黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040

基于中醫藥整合藥理學和轉錄組學探究丹梔逍遙散防治焦慮肝郁化火證的作用機制。采用中醫藥整合藥理學研究平臺v2.0，檢索并獲取丹梔逍遙散的活性成分及靶標、焦慮肝郁化火證靶標信息，構建中藥-成分-靶點-通路網絡。將交集基因導入String數據庫，構建交集靶點的蛋白互作網絡，以確定最終需要驗證的靶標。利用GEO數據庫轉錄組學驗證整合網絡藥理學結果，同時采用動物實驗進行驗證。共篩選出與焦慮肝郁化火證相關的靶標13個，丹梔逍遙散活性成分430種。整合藥理學結果顯示，丹梔逍遙散防治焦慮肝郁化火證主要通過調控α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸受體（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid receptor，AMPAR）、蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、-甲基--天冬氨酸（-methyl--aspartic acid，NMDA）受體的激活及磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）等信號通路。GEO微陣列芯片GSE4035數據集轉錄組學關鍵靶標雌激素受體α（estrogen receptor 1，）、腺苷酸環化酶 5（adenylate cyclase 5，）、谷氨酸離子型受體NMDA型亞基2A（glutamate ionotropic receptor NMDA type subunit 2A，）基因為差異表達基因（differential gene expression，DEGs）。實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）結果顯示，mRNA表達上調和mRNA表達下調。丹梔逍遙散可能是通過上調mRNA表達和下調mRNA表達進而調節腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）與其受體的結合和谷氨酸神經傳遞介導，進一步改善神經元生長、突觸傳導與突觸的可塑性，從而發揮其生物學效應。

丹梔逍遙散；焦慮；肝郁化火證；整合藥理學；轉錄組學

焦慮癥（anxiety）是以廣泛和持續性焦慮或反復發作的驚恐不安為主要特征，常伴有自主神經紊亂及運動性不安的疾病。臨床常分為廣泛性焦慮與驚恐障礙2種主要形式。廣泛性焦慮包括精神性焦慮、軀體性焦慮、心理性警覺、運動性不安和睡眠障礙；驚恐障礙患者主要在日?；顒又校蝗怀霈F強烈恐懼的典型表現[1]。中國國家衛生與健康調查統計數據顯示，在2012—2013年我國城市廣泛性焦慮障礙（36 086例焦慮患者）的發病率為5.3%[2]。在新型冠狀病毒肺炎流行期間，醫護人員的焦慮患病率高達40%[3]。在后疫情時代，新型冠狀病毒疫情對人們的生活、出行、學習以及自由活動產生了較大影響，從而產生負面情緒[4]。因此，對于焦慮癥的研究，特別是尋找中醫藥防治焦慮癥的有效方藥并闡明其機制是當前的關鍵和熱點，甚至在未來幾年將會是研究熱點。

焦慮癥實證層面的發病機制在于久郁化火，誠如朱丹溪在《丹溪心法·六郁》中所言：“氣血沖和，萬病不生，一有怫郁，諸病生焉”“凡郁病必先氣病”；劉河間曰：“六氣皆從火化……五志所傷皆化為熱”?？梢姟皻?郁-火”是焦慮癥發生發展的病理過程，焦慮癥實證患者臨床癥狀表現為一派陽亢行為，在精神上表現為提心吊膽、主觀過慮，但不能控制；行為上表現為患者軀體性主觀和客觀不適，如心悸、眩暈、多汗、呼吸困難等，以及運動性不安；除此之外，還有睡眠障礙和心理警覺等[5]。焦慮癥患者從臨床表現來看更符合“陰不制陽”的機制，“郁”則是發病的一個不可或缺的樞紐環節。焦慮癥虛證為主層面的發病機制在于心神耗損，久病必虛，《靈樞邪客》云：“心者，五臟六腑之大主也，精神之所舍也?！苯箲]患者長期的急躁易怒暗損人體的津液，其中心陰首當其沖，《靈樞經·口問》亦指出：“悲哀愁憂則心動，心動則五臟六腑皆搖”。心血不足、心陰虧耗則心失所養，陰不制陽，陰陽皆損，表現出心情郁悶、心慌多夢等。

焦慮證初期主要以肝郁氣滯為主，漸則痰凝、血郁、化熱，后期以氣血不足、陰虛火旺為主，病位主要在心、肝、腎，尤以肝為甚，氣機失調是發病的關鍵。有研究顯示焦慮證候要素頻率高于5%的有火熱、氣滯、陰虛[6]。丹梔逍遙散由牡丹皮、梔子、茯苓、白術、白芍、當歸、甘草和柴胡組成，出自明代薛己《內科摘要·卷下十一·各癥方藥》，具有清熱瀉火、建中補脾、養血柔肝和疏肝調達的功效，臨床上丹梔逍遙散已經廣泛運用在肝郁化火型廣泛性焦慮癥（障礙）的治療中，研究結果顯示可有效改善患者的焦慮癥狀[7-8]。

1 材料與方法

1.1 丹梔逍遙散化學成分庫的建立

利用中醫藥整合藥理學平臺[9]（http://www. tcmip.cn/，TCMIP v2.0）的中藥材數據庫和中藥成分數據庫，檢索“牡丹皮”“梔子”“柴胡”“白芍”“白術”“茯苓”“當歸”“甘草”所包含的化學成分信息，并建立“丹梔逍遙散化學成分庫”。

1.2 藥物靶標預測

利用TCMIP v2.0，設置Tanimoto Score為0.8（高準確度），提取“丹梔逍遙散化學成分庫”中藥物成分的化學分子指紋，預測化學成分的候選靶點譜，并將其與Drug Bank（http://www.drugbank.ca/）數據庫中獲美國食品藥品監督管理局批準的抗焦慮藥物指紋進行比對，將選定評分＞0.8相似性藥物靶點作為丹梔逍遙散藥物組合的候選靶點[10]。

1.3 疾病、證候靶標確定

在TCMIP v2.0的“疾病相關分子庫”中，以“anxiety”作為疾病關鍵詞進行檢索，檢索出的所有靶點作為焦慮癥的候選靶點集。

2020年《國際中醫臨床實踐指南·焦慮癥》將肝郁化火證臨床表現定義為情緒不寧、郁悶煩躁、胸脅脹痛、脘悶噯氣、不思飲食、大便不調，或見急躁易怒、口苦而干，或頭痛、目赤、耳鳴，或嘈雜吞酸、大便秘結，舌質紅、苔黃，脈弦或弦數[11]?！稄V泛性焦慮障礙中醫證候辨證分型及量化分級標準專家共識》將肝郁化火證臨床表現定義為主癥煩躁易怒，善太息，咽中不適，如物梗阻，敏感多疑；次癥為頭痛，面紅目赤，口苦咽干，兩肋脹滿，脘腹不適，痞滿納差，失眠多夢，女子月經不調，舌質紅或淡紅、苔黃或苔白，脈弦數[12]?？偨Y以上指南和專家共識，最后確定肝郁化火證臨床表型為煩躁、易怒、恐慌、緊張、擔憂、緊張性頭痛、頭暈、呼吸急促、心動過速、坐臥不寧、出汗、上腹不適、注意力困難。在TCMIP v2.0平臺數據庫，以irritation、anger、panic、nervousness、worry、tension headache、dizziness、shortness of breath、tachycardia、restlessness、sweating、upper abdominal discomfort、difficulty paying attention為關鍵詞，獲取肝郁化火證證候相關靶標。

1.4 蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡構建、分析與可視化

通過TCMIP v2.0的“網絡分析模塊”對PPI網絡進行拓撲分析，選取中藥靶點-疾病基因的關鍵節點（hubs）作為丹梔逍遙散活性成分的候選靶點，然后對關鍵靶標網絡進行通路富集分析，選取值（＜0.05）排名前20的通路[13]，構建完整的“中藥-核心靶標-關鍵通路”多層次關聯網絡，并進行可視化數據分析[13]。

1.5 核心靶點的微陣列芯片驗證

為檢驗中醫藥整合藥理學得到的核心靶點的可靠性，以“anxiety”為關鍵詞，檢索美國國立生物技術信息中心的GEO數據庫（https://www.ncbi.nlm. nih.gov/geo/），篩選anxiety相關的微陣列芯片數據集。采用R軟件（3.6.3版本）進行統計分析與可視化：利用GEOquery包（2.54.1版本）[14]下載數據，limma包（3.42.2版本）[15]進行差異表達基因分析，umap包（0.2.7.0版本）進行UMAP（uniform manifold approximation and projection）分析，ggplot2包（3.3.3版本）進行可視化，ComplexHeatmap包（2.2.0版本）[16]繪制熱圖。

1.6 實驗動物

9只雄性SFP級SD大鼠，體質量（200±20）g，11周齡。動物來源于北京斯貝福生物技術科技有限公司，生產許可證編號：SCXK（京）2019-0010。在云南中醫藥大學動物房適應性飼養3 d，自由飲水和攝取食物（普通飼料來源于云南楚商科技有限公司，生產批號20210711）。行為學實驗前1 d搬至行為學實驗室，適應24 h，保持與動物房相同的溫度（25 ℃）和濕度（60%～70%）。動物實驗經云南中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準，批準文號R-062021G106。

1.7 藥物

丹梔逍遙散組成藥物的飲片購買于云南中醫藥大學匯賢中醫醫院，由主管中藥師閆永啟主任鑒定，均符合《中國藥典》2020年版規定。8味中藥，每付共計78 g，見表1。將全部飲片浸泡在10倍體積的純水中，浸泡1 h，先武火煮開，后改用文火，煮1 h后濾過藥液。然后加入10倍體積的純水繼續二煎，1 h后混合2次濾過后的藥液。最后再將藥物濃縮成含生藥1.56 g/mL的水煎液，將煮好的水煎液放置冰箱保鮮層，每天給藥前2 h取出當天劑量，放置常溫環境待用。

表1 丹梔逍遙散藥物信息

1.8 動物分組、給藥及模型制備

9只大鼠適應性喂養3 d，按照隨機數字表法分組，分為丹梔逍遙散組、模型組和對照組，每組3只。3組均給予正常普通飼料和自由飲水，每天10:00時，丹梔逍遙散組大鼠給予丹梔逍遙散水提物（生藥15.6 g/kg），對照組和模型組大鼠給予等量的生理鹽水（10 mL/kg），共2周。除了對照組外，每天下午隨機時間開始對丹梔逍遙散組和模型組大鼠連續2周給予隨機慢性束縛應激（每天隨機使用特制束縛架將模型組和丹梔逍遙散組大鼠固定在內不能活動，束縛架如圓筒狀，大鼠頭部和四肢從圓筒孔中暴露出來，每天1次，每次2 h）進行造模。每隔3 d測1次體質量。第14天19:00時開始進行高架十字迷宮實驗，每只大鼠5 min，按時間順序進行。

1.9 高架十字迷宮實驗

采用高架十字迷宮實驗測試動物焦慮程度。高架十字迷宮實驗器材由2個開放臂（0.35 m×0.60 m）、2個封閉臂（0.35 m×0.60 m）以及交叉連接部（0.05 m×0.05 m）的開闊平臺組成。封閉臂有0.15 m高的黑色擋板，十字迷宮平臺離地面0.5 m。保持晝夜節律的光暗調整，實驗室在實驗過程中保持無燈光狀態，開始將大鼠面向開臂放在高架十字迷宮的交叉連接部中央，同時開始軟件記錄大鼠在高架十字迷宮實驗平臺的運動軌跡以及在不同部位的時間和次數。①進入開放臂次數（open arm entry，OE）：即進入到任一開放臂的次數，以大鼠4只爪子均進入到臂內為準，中途1只爪子從該臂中完全退出則為該次進入活動完成。②進入開放臂時間（open arm time，OT）：即進入開放臂的時間（s）。③進入封閉臂次數（close arm entry，CE）：即進入任一封閉臂的次數，以大鼠4只爪子均進入到臂內為準。④進入封閉臂時間（close arm time，CT）：即進入封閉臂的時間（s）。由以上指標計算進入開放臂次數比例（OE%）、開放臂停留時間比例（OT%）。上述記錄由SuperMaze動物行為學視頻分析系統完成，以排除測試過程的人為干擾因素。每次測試結束后清除糞便，并用75%乙醇清理迷宮，以掩蓋氣味。待乙醇蒸發后方可開始下1只動物實驗。

OE%＝OE/(OE＋CE)

OT%＝OT/(OT＋CT)

1.10 qRT-PCR驗證

1.10.1 主要儀器和材料 CFX Connect Real-Time System熒光定量PCR儀（美國Bio-rad），D3024R型離心機（美國SCILOGEX），Analytikjena-Easycycler普通PCR儀（德國Analytik Jena），Scandrop100型超微量核酸蛋白測定儀（德國Analytik Jena），移液器（美國Bio-rad），M2全自動加樣儀（四川科勁生物科技有限公司）。TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit反轉錄試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司，貨號pc70）；2×SYBR?Green預混液（成都丹鳳科技有限公司，貨號DF001）。

1.10.2 qRT-PCR實驗 各組大鼠麻醉后取腦組織，在冰塊上分離海馬組織和前額葉皮質，然后將海馬組織、前額葉皮質和剩余腦組織分別裝于1.5 mL離心管，迅速在液氮中凍存，放置于?80 ℃冰箱保存，委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成測序驗證。

提取對照組、丹梔逍遙散組和模型組大鼠海馬組織的總RNA，采用SYBR GREEN I檢測對照組、模型組和丹梔逍遙散組大鼠海馬組織RNA樣品3個目的基因腺苷酸環化酶5（adenylate cyclase 5，）、谷氨酸離子型受體NMDA型亞基2A（GRIN2A-glutamate ionotropic receptor NMDA type subunit 2A Gene，）、腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，）的mRNA表達量，用2?ΔΔCt方法計算各基因mRNA相對表達量。以磷酸甘油醛脫氫酶（reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，）為內參基因，所有實驗共進行3次，引物合成信息見表2。

1.11 統計分析

2 結果

2.1 丹梔逍遙散成分靶標預測及分析

通過TCMIPV2.0平臺對丹梔逍遙散化學成分的分析結果可知，共包含430種成分，候選靶標520個。對候選靶標進行基因功能分析和通路富集分析，發現其功能大多與谷氨酸受體信號通路、谷氨酸代謝過程、離子型谷氨酸受體信號通路、視黃醇代謝過程、-谷氨酸轉運、興奮性突觸后電位、γ-氨基丁酸信號通路正向調節密切相關，排名前20的功能和通路如圖1所示。

表2 引物信息

圖1 丹梔逍遙散成分候選靶標的功能和通路分析氣泡圖

2.2 焦慮疾病靶標及相關基因

對全疾病相關潛在靶標合并去重后，共獲得209個，其中與丹梔逍遙散密切相關的共同靶基因共13個，分別是長鏈酯酰輔酶A合成酶4（Acyl-CoA synthetase long chain family member 4，）、醛脫氫酶5家族成員A1（aldehyde dehydrogenase 5 family member A1，）、ATP酶Na+/K+轉運亞基α3（ATPase Na+/K+transporting subunit alpha 3，）、鈣敏感受體（calcium sensing receptor，）、兒茶酚--甲基轉移酶（catechol-methyltransferase，）、-氨基酸氧化酶（-amino acid oxidase，）、、（GNAS complex locus）、PI3K催化亞基p110alpha的編碼基因（）、轉化生長因子受體2（transforming growth factor beta receptor 2，）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，）、核受體亞家族3 C組成員1（nuclear receptor subfamily 3 group C member 1，）。

2.3 潛在靶點PPI分析

通過對13個靶點進行PPI分析，、、與其他靶標無關聯性。其他10個靶標體現出較高的中心度，其中以為主，見圖2。故在后續的驗證中優先驗證、、、、、、、、、。

2.4 丹梔逍遙散防治焦慮的“中藥-靶點-通路”多維網絡分析

TCMIP v2.0平臺采用人工智能、數據挖掘、網絡計算及可視化等方法和技術，形成7大整合藥理學分析模塊，包括疾病相關分子集及其功能挖掘、證候相關分子挖掘及功能分析、中藥（含方劑）靶標預測及功能分析、中藥藥性相關分子挖掘及功能分析、組方用藥規律分析、中醫藥關聯網絡挖掘和反向查找中藥（含方劑）。丹梔逍遙散防治焦慮的“中藥-靶點-通路”多維網絡圖是基于“中醫藥關聯網絡挖掘”構建，根據中藥方劑、中藥材、中藥成分、核心靶標、通路、疾病和證候之間的關聯性，可任意選擇不同類型的節點，構建中藥多維關聯網絡[17]。

圖2 13種關鍵靶點基因的PPI分析

如圖3所示，圖中五角星表示方劑丹梔逍遙散，正方形表示中藥，圓形表示靶標，橢圓形表示肝郁化火證臨床表型，三角形表示丹梔逍遙散防治焦慮肝郁化火證的相關通路。通過網絡圖可以一目了然地發現丹梔逍遙散防治焦慮肝郁化火證的關鍵網絡靶標及其作用機制，有助于揭示其科學內涵。

2.5 核心靶點微陣列芯片驗證結果

最終選定微陣列芯片數據集GSE4035。該數據集基于GPL1261 [Mouse430_2] Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 Array陣列平臺，包含12例焦慮RNA樣本（組2）和12例健康RNA樣本（組1）。由圖4可見，基因表達譜區分度良好，保證了后續差異表達分析的準確性。去掉空值后的ID總數為20 814個，滿足|log2(FC)|＞1和adj＜0.05閾值的ID有972個，在這閾值下，組2中高表達（log2FC為正）的數目有501個，組1中高表達（log2FC為負）的數目有471個；組間差異基因火山圖見圖5，熱圖見圖6。

圖3 丹梔逍遙散防治焦慮的“中藥-靶點-通路”多維網絡分析

GSE4035數據集的差異表達基因與、、、、、、、、、得到3個交集基因，分別是、和，證明了上述分析的可靠性。

2.6 動物實驗驗證結果

2.6.1 一般情況和體質量 造模期間，丹梔逍遙散組與對照組的大鼠皮毛光澤順滑，二便正常，日?；顒屿`敏。模型組大鼠變得較為暴躁，皮毛光澤暗淡。對照組大鼠體質量增長較快，丹梔逍遙散組和模型組大鼠的體質量增長較緩，與對照組相比差異均具有統計學意義（＜0.05）。

2.6.2 高架十字迷宮實驗 如圖7所示，在OT%方面，模型組低于對照組，差異具有統計學意義（＜0.01）；丹梔逍遙散組高于模型組，差異不具有統計學意義（＝0.069）。在OE%方面，模型組高于對照組，差異具有統計學意義（＜0.01）；丹梔逍遙散組低于模型組，差異具有統計學意義（＜0.01）。

圖4 焦慮數據集主成分分析

上調基因用紅色標記，下調基因用藍色標記，無差異的基因用灰色標記

2.6.3 qRT-PCR實驗結果 樣品中mRNA表達豐度低，有些樣本沒有t值，無法進行后續計算。與對照組比較，模型組mRNA表達量升高，但差異無統計學意義（＝0.056 7），mRNA表達量顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，丹梔逍遙散組mRNA表達量顯著降低（＜0.05），mRNA表達量顯著升高（＜0.001）（圖8）。表明這2個核心靶點基因的相對定量值與整合網絡藥理學的數據趨勢一致，證明整合網絡藥理學和GEO數據挖掘結果的可靠且重復性好。

圖8 qRT-PCR檢測大腦海馬組織中ADCY5和GRIN2A的mRNA表達量()

3 討論

3.1 焦慮肝郁化火證中醫病機與治療策略

焦慮屬于中醫“郁”的范疇。南宋的陳言提出“臟氣不行，郁而生涎……皆七氣所生所成”，郁是疾病發生的罪魁禍首，郁既有病的概念，也是證的范疇；明清時期，“郁”多被單列一門，《醫學正傳》首用“郁證”作為病名進行論述[5]。但對于“郁”的治療不僅是疏散之法，有研究顯示古代醫家治療郁多以“培土”為基礎，輔以疏肝，酌用清熱、行氣、安神之品[6]。

通過焦慮肝郁化火證的臨床證候表型可以看出，焦慮肝郁化火證患者實際臨床中往往呈現虛實夾雜，本虛標實，陰虛陽亢的病機，譬如運動性緊張、坐臥不寧、緊張性頭痛、顫抖、心動過速或呼吸急促、無法放松屬于虛陽外亢的臨床表現；擔憂、注意困難、頭重腳輕、出汗、頭暈、口干屬于正虛的臨床表現。丹梔逍遙散組方和功效劃分恰好符合焦慮肝郁化火證的整體病機，其中丹皮、梔子清熱瀉火治療陽亢于外，茯苓、炒白術、炙甘草建中補脾治療脾氣虧虛，當歸、白芍、柴胡養血柔肝補肝體而疏肝用?？傮w而言，焦慮肝郁化火證涉及主要病位在肝、脾，主要病性虛、實，丹梔逍遙散的組方符合焦慮肝郁化火證的發病機制。本研究借助TCMIP v2.0平臺，從中藥成分、證候要素、疾病靶點的多層次研究以及從藥物自身出發，較為全面地展現了中藥-證候-疾病-靶標-通路的銜接性研究，形成中醫藥現代研發體系，從分子角度解釋了中醫藥療效內涵[18]。

3.2 整合網絡藥理學結果分析

丹梔逍遙散化學成分分析，谷氨酸受體包括離子型受體和代謝性受體，離子型谷氨酸受體包括-甲基--天冬氨酸（-methyl--aspartic acid，NMDA）受體、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid，AMPA）受體和Kainate受體；應激狀態時，NMDARs會被過度激活，Ca2+通道反復開放，過多的Ca2+內流使細胞內Ca2+超載，引起神經細胞死亡[19]。應激狀態下，上調的AMPAR增加了腦內谷氨酸興奮性毒性，出現細胞內鈣累積，導致細胞穩態的破壞和腦組織的結構損傷[20]。代謝型谷氨酸2型受體和γ-氨基丁酸B受體屬于C家族G蛋白偶聯受體，分別是興奮性神經遞質谷氨酸和抑制性神經遞質γ-氨基丁酸的代謝型受體，γ-氨基丁酸B受體在中樞神經系統中介導緩慢的抑制性神經傳導和突觸可塑性調控，其活性的失調會導致細胞功能紊亂、損傷甚至細胞凋亡[21]。

“中藥-靶點-通路”多維網絡分析顯示，丹梔逍遙散通過調控AMPA受體、蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、AMPA受體的轉運、胰高血糖素信號中的PKA激活、NMDA受體激活、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）等信號通路，對蛋白質結合、胞質溶膠、質膜、細胞質、線粒體等通路進行干預。

ADCY5是一種腺苷酸環化酶，通過合成第2信使環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）來介導G蛋白偶聯受體的信號傳導。此外，cAMP也是一種典型的第2信使，其通過濃度的變化響應細胞外信號與細胞表面受體的結合，調節細胞內酶和非酶蛋白的活性，激活依賴于cAMP的PKA表達增加磷酸化水平，并調節等基因的表達，從而發揮生物學效應[22]。

GRIN2A是重要的谷氨酸離子向受體NMDA型亞基，焦慮樣行為與海馬中GRIN2A的上調有關，可通過調節與Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II（calcium-calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII）的結合來影響突觸的可塑性[23]。DAO是一種降解-絲氨酸的酶，是NMDAR的主要內源性共激動劑，滅活或缺失DAO將會加劇焦慮[24]。

雌激素受體1（estrogen receptor 1，）二核苷酸重復等位基因與90項癥狀清單（symptom check list 90，SCL-90）9個亞分數和總分之間的關聯結果顯示，其與SCL-90評分中焦慮、恐懼焦慮和總癥狀有顯著關聯[25]。已有的研究表明，變異與認知結果之間具有密切關系，初步證據表明基因在某些情緒中的作用，發現多態性與焦慮或抑郁癥狀關聯顯著[26]。

本研究旨在探討丹梔逍遙散治療焦慮的本質，完善和補充現有的研究。目前有諸多學者對丹梔逍遙散治療焦慮展開了深入研究，在生物學機制方面丹梔逍遙散可以顯著降低焦慮大鼠炎癥反應、機制細胞凋亡和和減輕護神經元損傷以及提高線粒體功能、提高腦源性神經營養因子和蛋白激酶蛋白表達，促進腦源性神經營養因子分泌，從而改善焦慮樣行為。初步闡明了丹梔逍遙散治療焦慮癥的作用機制和主要成分協同作用的機制，同時支撐了丹梔逍遙散在防治療焦慮癥方面的應用。

3.3 GEO數據庫驗證結果分析

GEO數據庫中轉錄組學驗證結果顯示，、、與焦慮肝郁化火證密切相關。雌激素在很大程度上通過其主要的ESR1和ESR2的細胞內激活來發揮其生物學作用。因此，雌激素受體的遺傳變異可能會改變雌激素信號，從而影響女性患者抑郁癥的易感性[27]。也有研究顯示，5-羥色胺基因與基因多態交互作用可能增加女性圍絕經期抑郁障礙患病的風險[28]。進一步驗證了基因是核心靶點基因之一。

可以通過調節基因的表達進而對谷氨酸損傷的神經元具有保護作用，BDNF可增加谷氨酸損傷皮層神經元NMDAR1 mRNA及蛋白的表達，增強其NMDA受體活性。同時GRIN2A是谷氨酸離子向受體NMDA型重要亞基，亦影響著NMDA受體的活性。因此，推測丹梔逍遙散可能是通過下調和上調基因的表達水平進一步上調BDNF表達和增加NMDA活性，發揮其生物學效應。

3.4 動物實驗驗證結果分析

高架十字迷宮實驗結果顯示，在OT%方面，雖然丹梔逍遙散組高于模型組，差異不具有統計學意義（＝0.069），但通過統計結果可以看出具有明顯的趨勢，其原因可能與樣本量少有關。在OE%方面，丹梔逍遙散組與模型組差異均具有統計學意義，說明丹梔逍遙散能改善焦慮模型大鼠進入開放臂的次數。

核心靶點基因驗證結果顯示，和mRNA表達量模型組與對照組、丹梔逍遙散組與模型組差異均具有統計學意義；核心靶點經qPCR實驗驗證，丹梔逍遙散能降低mRNA表達（＜0.05），升高mRNA的表達（＜0.001）。

4 結論

本研究對丹梔逍遙散組方候選靶標與焦慮癥進行關聯并以網絡可視化形式展現，并預測其可能靶標和分子信號通路。丹梔逍遙散調控的主要通路有AMPA受體的激活、PKA激活、胰高血糖素信號中的PKA激活、NMDA受體激活、PI3K/Akt等。中醫藥整合藥理學和GEO數據集獲取交集基因，包括、、基因；丹梔逍遙散可能通過上調mRNA表達和下調mRNA表達進一步調節BDNF表達和NMDA活性，進而調節BDNF與其受體的結合和NMDA活性，從而調節BDNF與其受體結合，進一步改善神經元生長、突觸傳導與突觸的可塑性，從而發揮其生物學效應。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 世界中醫藥學會聯合會, 中華中醫藥學會. 國際中醫臨床實踐指南焦慮癥(2020-10-11) [J]. 世界中醫藥, 2021, 16(8): 1188-1191.

[2] Yu W, Singh S S, Calhoun S,. Generalized anxiety disorder in urban China: Prevalence, awareness, and disease burden [J]., 2018, 234: 89-96.

[3] Saragih I D, Tonapa S I, Saragih I S,. Global prevalence of mental health problems among healthcare workers during the Covid-19 pandemic: A systematic review and meta-analysis [J]., 2021, 121: 104002.

[4] 劉璇. 后疫情時代的情緒穩定技術[J]. 東方養生, 2022(6): 138-139.

[5] 王劍峰. 琥珀香附寬心湯聯合鹽酸帕羅西汀治療肝郁氣滯型廣泛性焦慮癥的療效研究 [J]. 中國實用醫藥, 2020, 15(16): 148-149.

[6] 耿東. 基于現代文獻及臨床調研的廣泛性焦慮中醫證候及證候要素研究 [D]. 北京: 北京中醫藥大學, 2012.

[7] 王佳麗, 吳清明. 針刺聯合加味丹梔逍遙散治療氣郁化火型廣泛性焦慮癥的療效觀察 [J]. 中醫藥臨床雜志, 2021, 33(7): 1334-1337.

[8] 施丹. 丹梔逍遙散治療廣泛性焦慮癥(障礙)肝郁化火型臨床研究 [J]. 中國中醫藥現代遠程教育, 2018, 16(17): 106-108.

[9] Xu H Y, Zhang Y Q, Liu Z M,. ETCM: An encyclopaedia of traditional Chinese medicine [J]., 2019, 47(D1): D976-D982.

[10] Xue R C, Fang Z, Zhang M X,. TCMID: Traditional Chinese Medicine integrative database for herb molecular mechanism analysis [J]., 2013, 41(Database issue): D1089-D1095.

[11] 劉志超, 陳金紅, 高晟瑋, 等. 基于整合藥理學策略的黃芪-丹參抗心肌梗死作用機制研究 [J]. 中國中醫基礎醫學雜志, 2021, 27(10): 1644-1648.

[12] 中國中西醫結合學會精神疾病專業委員會. 廣泛性焦慮障礙中醫證候辨證分型及量化分級標準專家共識 [J]. 中醫雜志, 2022, 63(11): 1096-1100.

[13] 劉志超, 高晟瑋, 陳金紅, 等. 基于整合藥理學探究當歸四逆湯抗寒凝心脈型心肌梗死的作用機制 [J]. 中成藥, 2022, 44(4): 1121-1125.

[14] Davis S, Meltzer P S. GEOquery: A bridge between the gene expression omnibus (GEO) and BioConductor [J]., 2007, 23(14): 1846-1847.

[15] Gentleman R, Carey V J, Zhang J. Meta-data resources and tools in bioconductor [A] //[M]. New York: Springer-Verlag, 2005: 113-133.

[16] Gu Z G, Eils R, Schlesner M. Complex heatmaps reveal patterns and correlations in multidimensional genomic data [J]., 2016, 32(18): 2847-2849.

[17] 呂佳. 焦慮癥采用丹梔逍遙散治療的效果 [J]. 中國醫藥指南, 2021, 19(32): 30-32.

[18] 王玉, 楊雪, 靳曉杰, 等. 基于中醫藥整合藥理學平臺、GEO數據庫芯片及分子對接探討大黃抗肝癌的作用機制 [J]. 中草藥, 2020, 51(20): 5207-5219.

[19] 宋文悅, 高明奇, 梁澤懷, 等. 作用于-甲基--天門冬氨酸受體的抗抑郁藥物的研究進展 [J]. 中國新藥雜志, 2021, 30(15): 1396-1400.

[20] 周珊珊, 劉曉朦, Elona Khasanova, 等. 大麻二酚通過調節腦內AMPA受體表達改善癡呆模型大鼠認知損害 [J]. 中風與神經疾病雜志, 2022, 39(7): 596-600.

[21] 胡勇箭. 代謝型谷氨酸2型受體和γ-氨基丁酸B受體信號通路研究 [D]. 武漢: 華中科技大學, 2018.

[22] Wang W F, Wang Y C, Guo Q T,. Valerian essential oil for treating insomniathe serotonergic synapse pathway [J]., 2022, 9: 927434.

[23] Xu K, Wang M Y, Zhou W,. Chronic-ribose and-mannose overload induce depressive/anxiety-like behavior and spatial memory impairment in mice [J]., 2021, 11: 90.

[24] Pritchett D, Hasan S, Tam S K E,. D-amino acid oxidase knockout (Dao?/?) mice show enhanced short-term memory performance and heightened anxiety, but no sleep or circadian rhythm disruption [J]., 2015, 41(9): 1167-1179.

[25] Comings D E, Muhleman D, Johnson P,. Potential role of the estrogen receptor gene () in anxiety [J]., 1999, 4(4): 374-377.

[26] Sundermann E E, Maki P M, Bishop J R. A review of estrogen receptor alpha gene () polymorphisms, mood, and cognition [J]., 2010, 17(4): 874-886.

[27] Ryan J, Ancelin M L. Polymorphisms of estrogen receptors and risk of depression [J]., 2012, 72(13): 1725-1738.

[28] 陶晶, 仇劍崟, 顧紅亮, 等. ESR1基因與5-HTT基因多態性的交互作用對女性圍絕經期抑郁障礙的影響 [J]. 上海交通大學學報: 醫學版, 2012, 32(6): 766-770.

Discussion on mechanism of Danzhi Xiaoyao Powder in prevention and treatment of anxiety with liver depression transforming into fire syndrome based on integrative pharmacology of traditional Chinese medicine and transcriptomics

PAN Ci-ming1, 2, REN Xue2, 3, WEI Shan-shan1, CAO Bei-ling1, WANG Wei1, YANG Yan1, CHEN Wen-hui1, XU Hong-xi2

1. Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, China 2. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China 3. Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Harbin 150040, China

To explore the mechanism of Danzhi Xiaoyao Powder (丹梔逍遙散) in the prevention and treatment of anxiety with liver depression transforming into fire syndrome based on integrated pharmacology of traditional Chinese medicine and transcriptomics.The integrated pharmacology research platform of traditional Chinese medicine v2.0 was used to retrieve and obtain the active ingredients and target information of Danzhi Xiaoyao Powder, and the target information of anxiety with liver depression transforming into fire syndrome, and construct the network of traditional Chinese medicine-component-target-pathway. The intersection genes were imported into the String database, and the protein interaction network of intersection targets was constructed to determine the target that needed to be verified. The transcriptomic of GEO database were used to verify the integrated network pharmacology results, and animal experiments were used to verify the results.A total of 13 targets related to anxiety with liver depression transforming into fire syndrome and 430 kinds of active ingredients of Danzhi Xiaoyao Powder were screened out, and the integrated pharmacological results showed that Danzhi Xiaoyao Powder prevented and treated anxiety with liver depression transforming into fire syndrome by mainly regulating the activation of α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid receptor (AMPAR), protein kinase A (PKA),-methyl--aspartic acid (NMDA) receptor, phosphatidylinositide 3-kinases (PI3K) of protein kinase B (Akt) and other signal pathways of anxiety liver depression and fire syndrome. The GEO microarray GSE4035 data set, the key targets of transcriptomics estrogen receptor 1 (), adenylate cyclase 5 () and glutamate ionotropic receptor NMDA type subunit 2A () genes were differential gene expression (DEGs). Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) results showed thatmRNA expression was up-regulated andmRNA expression was down-regulated.Danzhi Xiaoxiao Powder may regulate brain-derived neurotrophic factor (BDNF) by up-regulating the expression ofmRNA and down-regulating the expression ofmRNA, thus regulating the binding of BDNF and its receptors and the neurotransmission of glutamate, further improve neuron growth, synaptic conduction and synaptic plasticity, so as to exert its biological effects.

Danzhi Xiaoyao Powder; anxiety; liver depression transforming into fire syndrome; integrative pharmacology; transcriptomics

R285

A

0253 - 2670(2023)12 - 3911 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.12.018

2023-02-23

國家自然科學基金項目（81703964）；云南省科技廳科技計劃項目（202101AZ070001-021）；云南省教育廳基金項目：基于GC-NLRP3炎癥小體通路研究丹梔逍遙散干預肝郁化火型焦慮行為大鼠的作用機制（2022Y332）；云南省科技廳科技人才與平臺計劃—云南省中醫藥學分子生物學重點實驗室[2019DG016BK-基于整合網絡藥理學探究丹梔逍遙散防治郁化火型焦慮行為的作用機制（30172110174），BK-丹梔逍遙散通過GC-NLRP3信號通路干預焦慮行為大鼠的機制研究（30172110179）]

潘賜明（1993—），男，在讀碩士研究生，研究方向為中西醫結合防治肝膽及腫瘤疾病的應用基礎研究。E-mail: panciming@ynutcm.edu.cn

通信作者：韋姍姍（1987—），女，云南昆明人，副教授，博士學位，主要從事證候的生物學基礎研究工作。E-mail: weiss814@163.com

[責任編輯 潘明佳]