溫州蒼南地區122例畬族MNS血型抗原和基因頻率調查

林飛飛，蔣賢國，劉秋菊，江明華

1.溫州醫科大學附屬蒼南醫院 輸血科，浙江 溫州 325800；2.溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 醫學檢驗中心，浙江 溫州 325027

目前國際輸血協會（International Society of Blood Transfusion, ISBT）發現并正式命名的紅細胞血型系統有43個，包含了345個紅細胞抗原[1]。 MNS血型系統（ISBT編號002）是繼ABO血型系統之后發現的第二個血型系統，其復雜性僅次于Rh血型系統[2]。我國目前對稀有血型系統的關注相對較 少，而歐美等多數發達國家已將MNS血型系統列入常規的檢測項目[3]。MNS血型系統的同種抗體特異性反應可導致血型鑒定困難、交叉配血不相容和輸血反應等，同時在器官移植、法醫學鑒定等方面均有著重要的應用[4-6]。人類紅細胞血型抗原會因社會變遷、地理位置、人種特征等有所差異。畬族是溫州地區人口最多、分布區域最廣的少數民族，調查畬族人群的紅細胞血型抗原分布情況，對豐富和完善溫州蒼南地區血型資源數據庫以及畬族患者的臨床用血、器官移植中心的組織配型等有重要意義。本研究對122名溫州蒼南地區畬族人進行MNS血清學抗原分析和基因頻率調查。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2021年10月至2022年4月溫州醫科大學附屬蒼南醫院蒼南地區三代以內無血緣關系的畬族健康志愿者122名，其中男53例（36～87歲），女69例（30～85歲），平均年齡為（64.9±11.3）歲。每位志愿者采集EDTA抗凝靜脈全血3～5 mL進行MNS表型鑒定，并提取DNA，于-20 ℃保存。參與研究的人員均簽署了知情同意書，且經溫州醫科大學附屬蒼南醫院倫理委員會審批（蒼醫倫理第2022074號）。

1.2 試劑與儀器 單克隆IgM血清Anit-M、Anit-N、Anit-S、Anit-s均由上海血液生物科技有限責任公司提供（批號20210104）；DNA提取試劑盒（批號202112003）和人類紅細胞MNSs基因分型測定試劑盒（SSP熒光PCR染料法，批號K202206004）均由天津秀鵬生物技術開發有限公司提供。實時熒光定量PCR儀（杭州博日科技股份有限公司），渦旋混勻器（海門其林貝爾儀器制造有限公司），高速離心機（德國Sigma公司）。

1.3 方法

1.3.1 MNS血清學分型檢測方法：取潔凈小試管，加入單克隆抗體試劑50 μL與受檢者2%～4%紅細胞懸液50 μL于試管中混勻，室溫（20～25 ℃）孵育15 min，將試管于1 000×g離心15 s后輕輕搖動，觀察是否凝集判讀結果。

1.3.2 基因組DNA提取：嚴格按照全血DNA提取試劑盒說明書操作提取樣本DNA，使用濃度為20～ 40 ng/μL，A260/A280值為1.6～2.0。

1.3.3 PCR方法擴增體系：嚴格按照人類紅細胞MNSs基因分型測定試劑盒說明書操作。通過針對紅細胞MNS血型系統基因設計特異性引物（見表1）。反應條件按要求設定PCR儀循環參數：96 ℃預變性2 min；96 ℃變性20 s，68 ℃退火60 s，5個循環；96 ℃ 20 s，65 ℃ 50 s，72 ℃ 45 s，10個循環；96 ℃ 20 s，62 ℃ 50 s，72 ℃ 45 s，15個循環；72 ℃延伸2 min，4 ℃保存。工作反應液用量（每人份樣本）=4 μL DNA+40 μL dNTP-Buffer II工作液。每孔各加入10 μL上述混合液，加入15～20 μL石蠟油，蓋好反應管；將引物板放入已經設置好參數的PCR儀內，并啟動PCR程序擴增，直到循環結束。

表1 MNS血型系統PCR-SSP引物序列

1.3.4 基因檢測結果分析：根據每孔的最高熔解曲線Tm值判斷孔位陰陽性，Tm值見表2。

表2 MNS血型基因型Tm值

1.4 統計學處理方法 采用SPSS25.0統計軟件進行數據分析。用χ2檢驗驗證基因頻率是否符合Hardy-Weinberg遺傳法；基因頻率=某基因的純合子頻率+1/2雜合子頻率；用χ2檢驗分析基因頻率的差別。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 溫州蒼南地區畬族人群MNS血型系統的等位基因頻率 M=0.566、N=0.434、S=0.037、s=0.963，MNS血型系統符合Hardy-Weinberg遺傳法則（P＞0.05），見表3。

表3 溫州蒼南地區畬族人群MNS血型基因頻率調查結果（n=122例）

2.2 MNS血型系統基因型的熒光PCR熔解曲線 溫州蒼南地區畬族人群當Tm值在陽性溫度范圍出現特征性熔解曲線峰，等位基因M陽性Tm值為79 ℃，等位基因N陽性Tm值為78 ℃，等位基因S陽性Tm值為78 ℃，等位基因s陽性Tm值為78 ℃，可得到MNSs基因型（見圖1）。

圖1 MNS血型系統基因型的熒光PCR熔解曲線

2.3 不同地域MNS血型系統等位基因頻率分布比較 溫州蒼南地區畬族人群與中國內蒙古、湖南、陜西、新疆、西藏、四川等地區隨機人群的MNS血型基因頻率比較結果顯示，溫州蒼南地區畬族人群MN等位基因頻率與西藏藏族差異有統計學意義（P＜0.05），與其他地區民族差異無統計學意義（P＞0.05）；溫州蒼南地區畬族人群Ss等位基因頻率與新疆維吾爾族、哈薩克族和西藏藏族差異有統計學意義（P＜0.05），與其他地區民族差異無統計學意義（P＞0.05）；見表4。

表4 溫州蒼南地區畬族人群MNS血型系統等位基因頻率與國內其他民族人群的分布比較

3 討論

MNS血型系統已被血清學證明包括至少46個血型抗原，受控于第4號染色體（4q28-31）上的MN和Ss兩個連鎖的基因，在臨床輸血和遺傳學研究中意義較大的分別為M、N、S、s抗原，其余大多數是低頻率或高頻率抗原。M和N是等位基因，組成MM、MN、NN 3種基因型，表現出M、MN、N 3種表現型。S和s是等位基因，組成SS、Ss、ss 3種基因型，表現出S、Ss、s 3種表現型。臨床上血型抗原的不配合輸注，容易刺激機體產生不規則抗體，不規則抗體主要以Rh和MNS為主[18]。近年來，因抗-M抗體引起的嚴重胎兒水腫和復發性流產以及新生兒溶血病的報道越來越多[19-21]。以上分析提示臨床MNS血型不合所引起免疫反應的輸血風險不容忽視，有必要考慮輸血前鑒定患者的MNS血型。不同種族和地域對MNS血型系統的差異性存在影響，了解畬族人群MNS血型系統表現型分布特點及其基因頻率可為紅細胞稀有血型庫建設提供一定的數據支持。

本研究使用熒光PCR方法完成了122名溫州蒼南地區畬族人群MNS稀有血型系統的基因型檢測。本方法基于單核苷酸熔解溫度差異而形成不同形態熔解曲線，通過對特征性熔解曲線Tm值判斷分型結果。該方法具有較高的靈敏度，可以檢測出單個堿基的差異，操作簡單，檢測時間短，且減少了PCR產物交叉污染的可能性。研究發現本地區畬族人群MNS血型系統的M等位基因頻率0.566，N等位基因頻率0.434，S等位基因頻率0.037，s等位基因頻率0.963。基因型以MN為主，占62.30%（76/122），MM型次之，占25.41%（31/122），NN型占12.29%（15/122）；基因型ss占92.62%（113/122），Ss占7.38%（9/122），s占主導地位，未檢測到SS基因型。M等位基因頻率（0.566）與西藏藏族（0.681）差異有統計學意義，與內蒙古蒙古族（0.609）、四川彝族（0.683）和其他地區漢族差異無統計學意義。N等位基因頻率（0.434）低于湖南漢族（0.502）、西安漢族（0.470）、新疆回族（0.480），但又高于蒙古族（0.391）、新疆哈薩克族（0.355）。S等位基因頻率（0.037）低于新疆維吾爾族（0.173）、新疆哈薩克族（0.143）和西藏藏族（0.147），且差異有統計學意義，s等位基因頻率（0.963）明顯高于新疆維吾爾族（0.801）、西藏藏族（0.853），但低于四川涼山彝族（0.980）。M、N基因在畬族與其他地區人群相比，基本上是M基因頻率低于南方民族，略高于北方民族，S基因頻率低于其他民族，處于低水平狀態。出現差異的可能原因是新疆維吾爾族、哈薩克族和西藏藏族在中國地理位置處于西北方，畬族主要分布在長江以南，民族遷移、地理位置和生態環境造成基因頻率的差異。另外，本次調查研究與溫州本地漢族人群MN血型基因頻率（M=0.537，N=0.463）非常接近[22]，可能是地域相近，互相通婚的原因。本研究采用χ2檢驗法比較基因表現型的觀察值與期望值的差異，得到MNS稀有血型系統的基因頻率分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡法則。本研究發現溫州蒼南地區畬族人群MNS血型系統的MN血型基因頻率符合少數民族M＞N的遺傳規律[22]，且與當地漢族人群有逐步同化趨勢，但與其他少數民族相比仍具有自身特點。

有研究表明：感染疑似病毒/細菌的患者會改變其免疫原性產生抗-M[23]。MN基因定型檢測在器官移植早期檢測、法醫學鑒定等方面均有應用。因此，MNS血型系統檢測及基因頻率調查對于血型與疾病相關性研究也具有重要意義。目前浙江省稀有血型獻血者資料庫主要是以Rh（D）抗原陰性的資料為主，其他的稀有血型資料庫有待于進一步完善。本研究為本地區畬族人群紅細胞稀有血型庫的建設提供數據支持，有利于建立相應的血源庫，為畬族人群血液學研究、民族遷移、器官移植配型等方面提供了支撐，并對本地區血型鑒定結果的準確性和臨床輸血安全等方面具有重要的臨床指導意義。人類紅細胞血型抗原的地域性特征比較明顯，可能還有相關基因的堿基突變未被發現，有待增加標本量對溫州地區畬族人群的血型系統進行更深入廣泛的研究。