基于代謝組學分析堿性成纖維細胞生長因子對糖尿病小鼠肝損傷的作用

于雯飄，舒琦，魏婷婷

1.溫州醫(yī)科大學 第一臨床醫(yī)學院（信息與工程學院），浙江 溫州 325035；2.浙江省腫瘤醫(yī)院 藥劑科，浙江 杭州 310022；3.溫州醫(yī)科大學 實驗動物中心，浙江 溫州 325035

糖尿病是一種因胰島素抵抗、胰島素分泌不足或兩者兼有而引起的以高血糖為主要特征的代謝性疾病。糖尿病患者長期高血糖會導致各種器官和組織的慢性損害和功能障礙，從而引發(fā)一系列累及全身的并發(fā)癥，包括視網(wǎng)膜病變、腎病、心肌病、肝病和認知功能障礙等，其中糖尿病肝損傷的發(fā)生率越來越高，多發(fā)于2型糖尿病，以非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）最常見[1]。由于胰島素抵抗引起的糖脂代謝紊亂致使肝細胞中脂質(zhì)積累過多，不僅會干擾代謝過程，還會導致肝細胞線粒體功能障礙，氧化磷酸化減少，氧化應激增加，以及超微結(jié)構(gòu)異常，最終造成NAFLD、肝纖維化、肝硬化甚至肝癌[2]。目前，雖然對糖尿病肝病進行了一些研究，但其病理生理機制尚未闡明，仍然缺乏有效的治療策略和治療藥物。成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor, FGF）是廣泛分布于人體內(nèi)的生長因子，對糖尿病的治療具有巨大潛力。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)FGF19、FGF21、FGF23等對心血管疾病以及非酒精性脂肪肝等疾病的治療起重要作用[3]。但是堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor basic, bFGF）對糖尿病肝損傷的研究較少，其是否可以改善糖尿病肝損傷引起的代謝紊亂及其代謝機制尚不清楚。代謝組學在疾病的早期診斷和機制研究以及藥物研發(fā)等領域均已有廣泛應用。本研究通過基于核磁共振氫譜（1H nuclear magnetic resonance,1H NMR）的代謝組學方法探討bFGF與糖尿病肝損傷之間的關系和可能的代謝機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 9只雄性C57BL/6J野生型小鼠，體質(zhì)量20～30 g，14只8周齡雄性自發(fā)性糖尿病db/db小鼠，體質(zhì)量50～70 g，均購自南京大學模式動物研究所，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學實驗動物中心。小鼠均進行適應性飼養(yǎng)1周后進入下一步實驗，飼養(yǎng)期間自由飲食、飲水。實驗動物許可證號：SYXK（浙）2020-0014。

1.2 主要試劑與儀器 D2O（99.9%氘代）購自英國劍橋同位素實驗室，三甲硅烷基丙磺酸鈉（TSP）購自美國Sigma公司，Bruker AVANCE III 600 MHz NMR波譜儀購自德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組和給藥：將6只C57BL/6J小鼠設為對照組（wt組），5只db/db小鼠為糖尿病肝損傷組（db/db組），9只db/db小鼠為bFGF給藥組（bFGF組）。用0.9%氯化鈉溶液將bFGF稀釋成0.2 mg/mL后保存于-80 ℃冰箱備用。所有小鼠飼養(yǎng)至10周齡后開始實驗，bFGF組小鼠每隔1 d腹腔注射1次bFGF，注射時間均為早上8點，注射劑量為0.5 mg/kg，注射10周后處死小鼠。而wt組和db/db組在相同時間注射0.9%氯化鈉溶液作為對照。

1.3.2 樣本收集：小鼠飼養(yǎng)至20周時，通過脫臼處死小鼠后快速分離出肝臟組織裝入凍存管，經(jīng)液氮速凍后于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.3.3 肝臟組織HE染色：分離肝臟組織，4%多聚甲醛溶液固定6 h，用不同濃度的乙醇和二甲苯逐級脫水，石蠟包埋，作3～5 μm切片，HE染色，在200倍顯微鏡下觀察肝臟組織形態(tài)學變化。

1.3.4 肝臟樣本代謝物提取：采用甲醇-氯仿-水法提取肝臟組織中水溶性的小分子代謝物[4]。取冰凍組織稱重后移至EP管中，分別加入4 mL/g甲醇、4 mL/g氯仿和2.85 mL/g蒸餾水，運用高通量粉碎機（60 Hz，2 min）勻漿使組織破碎呈現(xiàn)均勻的漿液后，渦旋15 s，然后把樣品置于冰上15 min后，在 4 ℃、5 000×g條件下離心15 min，取上清液，通過液氮預凍后置于冷凍干燥機中凍干48 h至粉末狀。NMR樣品的制備：取凍干的樣品加入含0.04 mmol/L TSP的D2O 500 μL，渦旋15 s至充分溶解后在4 ℃、12 000×g條件下離心10 min，最后將上清液轉(zhuǎn)移至5 mm NMR樣品管中待1H NMR圖譜采集。

1.3.5 肝臟組織的1HNMR檢測：使用Bruker AVANCE III 600 MHz超導高分辨核磁共振譜儀進行采集1H NMR圖譜。具體參數(shù)如下：標準溫度298 K，zgpr標準脈沖序列，預飽和方式壓制水峰，譜寬為12 000 Hz，數(shù)據(jù)采集點數(shù)為64 K，弛豫延遲為6 s，累加次數(shù)為128次，掃描時間為2.65 s。

1.3.61HNMR譜圖的數(shù)據(jù)處理和分析：采用Bruker Topspin軟件對采集的1H NMR圖譜進行相位和基線的調(diào)整，對TSP峰定標（δ=0 ppm）。由于葡萄糖峰非常明顯，對后續(xù)分析結(jié)果的干擾很大，因此需要將其去除[5]。為消除飽和水峰帶來的譜線扭曲，去除預飽和壓水峰后殘留的水峰區(qū)。對每段積分值都相對于該譜的所有積分值進行歸一化處理后，將數(shù)據(jù)導入SIMCA-P+12.0軟件包（瑞典Umetrics公司）進行多元統(tǒng)計分析。采用偏最小二乘判別分析（partial least-squares discriminant analys,PLS-DA）探討多組代謝模式的差異。PLS-DA圖上的每個點代表一個樣本的代謝模式，PLS-DA圖對應的loading圖反映積分區(qū)間對PLS-DA圖中分組的貢 獻[6-7]。

1.4 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肝組織病理形態(tài)改變 HE染色結(jié)果顯示，wt組小鼠肝小葉和肝竇結(jié)構(gòu)清晰，細胞大小形態(tài)一致；db/db組小鼠肝細胞脂肪變性明顯，可見局灶性壞死及炎細胞浸潤；bFGF干預后，脂滴和炎性細胞明顯減少，細胞壞死損傷減輕。見圖1。

圖1 wt組、db/db組和bFGF組肝臟組織的HE染色（×200）

2.2 小鼠肝臟組織1H NMR譜結(jié)果 通過1H NMR譜可以同時獲得許多小分子代謝物信息，其代謝物歸屬為：亮氨酸（δ 0.95）、異亮氨酸（δ 1.0）、纈氨酸（δ 1.04）、3-羥基丁酸（δ 1.2）、乳酸（δ 1.32，δ 4.1）、丙氨酸（δ 1.49）、乙酸（δ 1.91）、谷胱甘肽（δ 2.1，δ 2.55）、琥珀酸（δ 2.41）、谷氨酰胺（δ 2.45）、肌酐（δ 3.04）、膽堿（δ 3.21）、牛磺酸（δ 3.42）、甘氨酸（δ 3.55）、葡萄糖（δ 3.4～4.0）、麥芽糖（δ 5.42）、尿苷（δ 5.91）、三磷酸鳥苷（δ 5.95）、肌苷（δ 6.11，δ 8.28）、腺苷一磷酸（δ 6.14，δ 8.61）、延胡索酸（δ 6.52）、苯丙氨酸（δ 7.42）、煙酰胺（δ 7.59）、延胡索酸（δ 6.52）。見圖2。

圖2 小鼠肝臟組織的典型600 MHz 1H NMR譜圖

2.3 PLS-DA結(jié)果 PLS-DA模式識別圖中，wt組、db/db組和bFGF組小鼠肝臟的代謝模式能夠明顯區(qū)分開，說明3組小鼠肝臟的代謝模式有明顯差別 （見圖3A），對應的模式置換圖也顯示所建立的PLSDA模型是可行的（見圖3B）。相應的彩色loading圖結(jié)果表明，乳酸、谷胱甘肽、琥珀酸、膽堿、牛磺酸和苯丙氨酸對3組的區(qū)分有較大貢獻（見圖3C）。

圖3 wt組、db/db組和bFGF組肝臟組織的PLS-DA模式識別圖（A）、置換檢驗圖（B）和彩色loading圖（C）

為進一步篩選2組之間肝臟中重要的差異代謝物，本研究對wt組、db/db組和bFGF組兩兩之間進行了PLS-DA分析，其結(jié)果顯示，3組兩兩之間的代謝模式均存在明顯的差異。同時，通過PLS-DA圖相對應的loading圖分析差異代謝物，結(jié)果顯示乳酸、谷氨酰胺、肌酐、谷胱甘肽、琥珀酸、丙氨酸、膽堿和牛磺酸是造成3組兩兩之間代謝差異貢獻較大的特異性代謝物。見圖4。

圖4 wt組、db/db組和bFGF組肝臟組織的PLS-DA模式識別和對應的loading圖

2.4 代謝物定量分析 與wt組相比，db/db組小鼠肝臟中亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、乳酸、琥珀酸、肌酐、甘氨酸、三磷酸鳥苷和苯丙氨酸的代謝水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；但給予bFGF治療后，bFGF組小鼠肝臟中亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、乳酸、琥珀酸、肌酐、甘氨酸、三磷酸鳥苷和苯丙氨酸的代謝物水平顯著高于db/db組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。這些代謝產(chǎn)物主要涉及能量代謝、氨基酸代謝和核苷酸代謝。見圖5。

圖5 wt組、db/db組和bFGF組小鼠肝臟組織中差異代謝物的比較

3 討論

據(jù)統(tǒng)計，到2035年全球糖尿病發(fā)生預計將達到5.92億，糖尿病與肝臟病變有一定的關聯(lián)，超過70%的糖尿病患者會出現(xiàn)肝損傷[8]，這與胰島素抵抗和糖脂代謝異常密切相關[9]，糖尿病肝損傷的具體發(fā)病機制目前還不清楚。目前干預糖尿病肝損傷的措施主要是通過降低血糖的基礎上，依靠干預生活方式來降低體質(zhì)量，從而降低代謝性疾病的風險來實現(xiàn)，所以目前的治療策略很有限。db/db小鼠是因瘦素受體基因突變引起的先天性肥胖的2型糖尿病模型，其糖尿病病程與人非常相似，是研究糖尿病肝損傷的理想模型[10]。近年來有研究[11]發(fā)現(xiàn)，bFGF夠顯著抑制db/db小鼠空腹和餐后血糖水平升高，改善胰島素抵抗，但是bFGF治療糖尿病肝損傷的具體機制尚不清楚。本研究從代謝角度出發(fā)探討bFGF對糖尿病肝損傷的作用，為糖尿病肝損傷的治療提供新視角。

肝臟是人體重要的代謝器官，肝病患者存在非常復雜的代謝紊亂，近年來科學家發(fā)現(xiàn)氨基酸代謝、能量代謝、甲胺代謝等與肝病的發(fā)病過程密 切相關[12]。支鏈氨基酸（branched-chain amino acids, BCAAs）是一類人體營養(yǎng)必需氨基酸，包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸。BCAAs是機體重要的能源物質(zhì)，主要在心肌、神經(jīng)元和腎臟等組織中分解代謝。BCAAs不僅參與合成蛋白質(zhì)，還作為有效的細胞營養(yǎng)分子參與調(diào)控新陳代謝和細胞生長。近年來，眾多研究[13-14]表明血漿BCAAs水平異常對神經(jīng)、心血管、代謝疾病和癌癥等疾病均有影響。其代謝與胰島素分泌及胰島素敏感性有關，并被認為是未來糖尿病風險的預測因子[15]。由于BCAAs在全身氮代謝中的特殊作用和血腦屏障運輸中的競爭性作用，廣泛應用于肝病患者。在一些研究中發(fā)現(xiàn)，補充BCAAs可有效下調(diào)肝硬化患者的蛋白質(zhì)代謝，改善氮平衡，最終導致更好的臨床結(jié)果[16]。本研究發(fā)現(xiàn)db/db小鼠BCAAs代謝明顯低于wt組，值得注意的是，這種代謝異常在bFGF治療后可以被恢復。結(jié)果表明bFGF對糖尿病肝損傷的作用機制可能與調(diào)節(jié)支鏈氨基酸代謝有關。與wt小鼠相比，db/db小鼠肝臟組織中甘氨酸的水平下降。肝是糖異生的主要器官，甘氨酸是重要的生糖氨基酸，它的水平下降可能表明在糖尿病發(fā)展成糖尿病肝損傷的過程中，糖異生途徑增強，或者反映肝功能受損。由于肝功能受損導致氨基酸濾過增多，使組織中生糖氨基酸含量減少。說明糖異生與糖尿病肝損傷的發(fā)病機制是密切相關的。甘氨酸是一種非必需氨基酸，劉近春等[17]發(fā)現(xiàn)甘氨酸通過拮抗內(nèi)毒素可以減輕脂肪肝的程度。據(jù)研究[18]報道，甘氨酸可抑制細胞凋亡和調(diào)節(jié)免疫力來抑制大鼠應激性肝損傷。本研究結(jié)果表明，bFGF給藥能顯著改善db/db小鼠肝臟組織中甘氨酸水平，這表明bFGF治療糖尿病肝損傷可能通過改善甘氨酸代謝來實現(xiàn)。苯丙氨酸是很多生物學上重要物質(zhì)的前體物質(zhì)，如甲狀腺激素類、兒茶酚胺類、黑色素、蛋白質(zhì)，是人體的必需氨基酸。肝臟是苯丙氨酸代謝的主要場所，苯丙氨酸代謝水平可能反映肝臟的一個狀態(tài)[19]。SELKOE[20]研究發(fā)現(xiàn)小麥蛋白水解液合劑（絡氨酸、苯丙氨酸加碳水化合物）可作為營養(yǎng)補充劑快速升高健康人群的胰島素水平。本研究發(fā)現(xiàn)，與wt組小鼠相比，db/db組小鼠肝臟組織中苯丙氨酸水平顯著下降，而bFGF干預后可以在一定程度上恢復苯丙氨酸的異常代謝。所以，本研究結(jié)果表明bFGF可能通過改善氨基酸的代謝紊亂來保護糖尿病肝損傷。

葡萄糖代謝是維持機體生命活動能量的主要來源，是生命體主要的能量代謝，包括葡萄糖有氧氧化和糖酵解。有文獻[21]報道指出，糖尿病動物模型體內(nèi)糖異生加強，糖原分解加快，這使得內(nèi)源性葡萄糖增加，并引發(fā)高血糖，相關的三羧酸循環(huán)和糖酵解途徑也發(fā)生了紊亂。研究[22]報道肝衰竭患者肝功能嚴重損傷，導致三大物質(zhì)代謝異常，血乳酸水平能較為準確的預測肝衰竭患者。與wt小鼠相比，db/db小鼠肝臟中三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物琥珀酸水平和糖酵解產(chǎn)物乳酸顯著降低，這可能反映了高血糖產(chǎn)生的全身應激作用，與疾病的發(fā)病特點有關。而bFGF干預治療后，琥珀酸和乳酸水平顯著升高了。三羧酸循環(huán)和糖酵解途徑中相關代謝物的變化表明bFGF對糖尿病肝損傷的作用與能量代謝密切相關。

三磷酸鳥苷是轉(zhuǎn)錄反應中鳥嘌呤核苷酸的提供者，為所有生命形式的基本單元，對代謝、心血管和神經(jīng)等有重要作用。MEREDITH等[23]研究發(fā)現(xiàn)三磷酸鳥苷可以調(diào)節(jié)Ca2+誘導的胰島素分泌。在臨床上，三磷酸鳥苷可用于慢性肝炎、進行性肌萎縮等疾病的治療[24]。db/db小鼠肝臟組織中三磷酸鳥苷水平的下降表明在糖尿病肝損傷發(fā)展過程中核苷酸代謝發(fā)生了紊亂。在本研究中，bFGF干預可以升高db/db小鼠肝臟中的三磷酸鳥苷。這提示bFGF對db/db小鼠糖尿病肝損傷的作用可能與核苷酸代謝有關。

肌酐是腎功能損傷的重要標志物[25]。肌酐主要來源是胃源性蛋白質(zhì)攝入及肌肉代謝，在代謝過程中需要一些酶的參與，一些相關的酶由肝臟合成。當肝功能出現(xiàn)損害時，會導致肌酐生成、代謝受到影響，特別是肝臟功能出現(xiàn)衰竭時，容易出現(xiàn)肝腎綜合征。王小華等[26]指出應用血清中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白聯(lián)合血清肌酐能在早期準確診斷乙型肝炎肝硬化患者并發(fā)肝腎綜合征。在本研究中，發(fā)現(xiàn)bFGF干預可以改善db/db小鼠肝臟中肌酐的異常降低。

綜上所述，本研究運用基于1H NMR的代謝組學方法探究了bFGF與糖尿病肝損傷之間的關系，發(fā)現(xiàn)bFGF可以改善糖尿病肝損傷肝臟組織的代謝紊亂，主要涉及到能量代謝、氨基酸代謝和核苷酸代謝，為bFGF治療糖尿病肝損傷提供新思路。