水中跑臺(tái)訓(xùn)練通過促進(jìn)水通道蛋白4的極性表達(dá)減輕大鼠脊髓損傷后的組織水腫

謝慶鳳，謝媛媛，胡權(quán)，陳曉龍，林堅(jiān)煒，應(yīng)新旺

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 康復(fù)醫(yī)學(xué)中心，浙江 溫州 325027

脊髓水腫是繼發(fā)性脊髓損傷（spinal cord injury, SCI）的關(guān)鍵病理過程之一，對(duì)脊髓功能的預(yù)后恢復(fù)有重要影響[1-2]。目前治療脊髓水腫的方法有限，主要針對(duì)破壞性水腫發(fā)展后的對(duì)癥治療，療效欠佳[3]。因此，根據(jù)脊髓水腫的發(fā)生和發(fā)展規(guī)律采取相應(yīng)的康復(fù)措施來抑制脊髓水腫發(fā)展并消退水腫至關(guān)重要。星形膠質(zhì)細(xì)胞的基底膜、周細(xì)胞和末端足突構(gòu)成血脊髓屏障（blood-spinal cord barrier, BSCB）系統(tǒng)，保護(hù)和調(diào)節(jié)脊髓實(shí)質(zhì)[4-6]。水通道蛋白4（aquaporin 4, AQP4）廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是調(diào)節(jié)水通透性和水代謝的主要分子途徑[7-8]。當(dāng)血管源性水腫時(shí)，血管周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞終足膜上密集表達(dá)的AQP4在流體靜力壓的驅(qū)動(dòng)下，介導(dǎo)水從細(xì)胞外間隙轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)毛細(xì)血管，加速水分清除，減輕水腫。這種細(xì)胞特定部位的表達(dá)形式稱之為AQP4的極性表達(dá)[3，9]。運(yùn)動(dòng)療法是目前臨床上SCI后有效的康復(fù)措施之一[10-11]。由于大鼠SCI后不能進(jìn)行正常的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，本課題組將運(yùn)動(dòng)和水療相結(jié)合，設(shè)計(jì)水中跑臺(tái)進(jìn)行訓(xùn)練來模擬臨床上的運(yùn)動(dòng)療法。本研究旨在探討水中跑臺(tái)訓(xùn)練（water treadmill training, TT）對(duì)大鼠SCI后脊髓水腫的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：80只清潔級(jí)2～3月齡SD大鼠，體質(zhì)量220～250 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。本研究已通過溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審批（編號(hào)：wydw2020-0602），符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.1.2 試劑：AQP4抗體和CD31抗體（美國Affinity 公司）；GFAP和Tubulin抗體（美國Abcam公司）；山羊抗兔/山羊抗小鼠二抗（上海翌圣生物科技有限公司），EB染料試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司），HE染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：將大鼠按隨機(jī)數(shù)字法分為假手術(shù)不處理組（Sham-Con）、假手術(shù)運(yùn)動(dòng)組（Sham-TT）、脊髓損傷組（SCI-Con）和脊髓損傷運(yùn)動(dòng)組（SCI-TT），每組各20只。

1.2.2 大鼠SCI模型制作：術(shù)前對(duì)大鼠進(jìn)行24 h的空腹禁食處理。首先進(jìn)行2%戊巴比妥鈉（0.6 mL/100 g） 腹腔注射麻醉，找到大鼠第十三肋骨體表標(biāo)記及棘突做一個(gè)約3 cm的縱行切口，精確定位T9-T11，暴露出棘突和椎板，用咬骨鉗摘除椎板。充分暴露脊髓實(shí)質(zhì)長度約1 cm后，用紐約大學(xué)脊髓打擊器精確撞擊目標(biāo)區(qū)域制作大鼠脊髓不完全損傷模型（T10打擊，2.5 cm 10 g）。脊髓打擊節(jié)段表面迅速出現(xiàn)局部水腫、淤血但硬脊膜完整以及大鼠雙下肢及尾部出現(xiàn)抽動(dòng)等表現(xiàn)即視為造模成功，接著再逐層縫合肌肉組織，術(shù)后注意大鼠體溫的控制。術(shù)后早晚各行1次協(xié)助排尿排便，同時(shí)給予青霉素預(yù)防傷口感染。

1.2.3 大鼠行為學(xué)評(píng)分：Bssso Beattie Bresnahan （BBB）評(píng)分分別于造模后1、3、7、14 d，晚上 19：00—20：00進(jìn)行。將大鼠后肢功能分為22個(gè)等級(jí)，最小值0分，最大值21分。為避免個(gè)人主觀因素對(duì)評(píng)分結(jié)果的影響，BBB評(píng)分過程采用雙盲、雙人獨(dú)立觀察記錄，結(jié)果取平均值[4]。

1.2.4 含水量檢測(cè)：用2%戊巴比妥鈉過度麻醉后，快速取出大鼠T10脊髓，稱量濕重，然后在80 ℃的溫度干燥箱中干燥24 h至恒定重量。該節(jié)段水腫程度按（濕重-干重）/濕重×100%進(jìn)行計(jì)算。

1.2.5 EB染料分析：大鼠尾靜脈注射EB染料 （4 mL/kg）。將含T10的脊髓組織放入溫度為50 ℃的二甲基甲酰胺中72 h。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定各組樣品中EB染料的濃度（μg/g）。

1.2.6 TT：水溫設(shè)置在30 ℃，水深至大鼠胸骨劍突處。運(yùn)動(dòng)組大鼠在SCI造模前3 d予適應(yīng)性跑臺(tái)（6～10 m/min，15 min）。術(shù)后第2天Sham-TT/SCITT組大鼠開始正式跑臺(tái)訓(xùn)練（10～15 m/min，5 min為1組，共3組，組間間歇5 min，共訓(xùn)練14 d）。

1.2.7 Western blot檢測(cè)AQP4和GFAP蛋白：用BCA法測(cè)蛋白，以60 μg蛋白量為標(biāo)準(zhǔn)，以15 μL為上樣量配置上樣樣品。電泳起始時(shí)用80 V，待Mark進(jìn)入分離膠后，再用120 V電泳至Mark跑至凝膠底部。用300 mA恒流電轉(zhuǎn)膜約90 min。轉(zhuǎn)膜后置入5%脫脂牛奶中封閉2 h。然后加入一抗4 ℃過夜。隔日TBST漂洗后加入二抗（1:2 000）室溫孵育1 h。ECL顯影后用ImageJ軟件對(duì)條帶吸光度值進(jìn)行分析。

1.2.8 HE染色：切好的石蠟切片放置于65 ℃烘箱烤片1 h。將載玻片依次放入通風(fēng)櫥內(nèi)的二甲苯溶液①②中，每個(gè)搪瓷杯中放置10～15 min。將脫好蠟的玻片，依次放入100%、100%、90%、90%、85%、75%乙醇中，每個(gè)5 min，梯度脫水。雙蒸水浸泡 10 min，取出后放入蘇木精水溶液中染色2 min。自來水沖洗30 s，酸水及氨水中分色，各數(shù)秒。玻片流水沖洗1 h后入雙蒸水片刻，再入75%無水乙醇（5 min）、85%無水乙醇（5 min）、95%無水乙醇（5 min）。入伊紅液染色2～3 min。透明：100%無水乙醇（5 min）、100%無水乙醇（5 min）、二甲苯 （5 min）、二甲苯（5 min）。將已透明的切片滴上中性樹脂，蓋上蓋玻片封固。待樹脂略干后，貼上標(biāo)簽，標(biāo)記標(biāo)本。在顯微鏡下觀察并采集圖片。

1.2.9 免疫熒光三標(biāo)染色：石蠟切片脫蠟漂洗后，用10%山羊血清在室溫下封閉2 h，滴加兔抗大鼠AQP4抗體（1:100）、山羊抗大鼠CD31抗體（1:100）/小鼠抗大鼠GFAP抗體混合液（1:100）于濕盒中孵育（4 ℃）16～20 h。復(fù)溫漂洗后滴加二抗（混合液孵育2 h，避光），漂洗后經(jīng)10% DAPI染核5 min（避光），最后滴加防熒光猝滅劑封片，在熒光顯微鏡下顯影觀察拍照。

1.2.10 免疫電鏡：灌注取脊髓組織，經(jīng)固定-梯度脫水-包埋后進(jìn)行連續(xù)切片，選擇厚為70～80 nm的超薄切片，置于超純水懸浮5 min，清洗封閉后加一抗4 ℃過夜孵育，隔日加二抗后進(jìn)行鈾復(fù)染，最后烘干后在透射電子顯微鏡下觀察并采集圖像，黑色10 nm大小的金顆粒即為陽性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)以±s表示，使用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)作為正態(tài)檢驗(yàn)，方差齊性檢驗(yàn)采用Levene檢驗(yàn)；組間差異分析采用單因素方差分析和Tukey’s檢驗(yàn)；當(dāng)方差不齊時(shí)采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TT對(duì)大鼠SCI后組織形態(tài)和水腫的影響 與Sham-Con組比，Sham-TT組大鼠脊髓含水量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；SCI-Con組大鼠脊髓的含水量較Sham-Con組顯著增加（P＜0.05）。與SCI-Con組比，SCI-TT組大鼠組織含水量顯著下降（P＜0.05），見圖1A、圖1C。通過HE染色觀察T9-T11水平脊髓前角的組織形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果顯示Sham-Con組和Sham-TT組未見明顯的病理改變；與Sham-Con組相比，SCICon組大鼠脊髓前角灰質(zhì)嚴(yán)重受損，神經(jīng)元排列紊亂，細(xì)胞腫脹、結(jié)構(gòu)模糊、核固縮溶解；與SCI-Con組大鼠相比，SCI-TT組大鼠前角組織排列更規(guī)則、組織的病理學(xué)改變均有不同程度地減輕，見圖1B。BBB評(píng)分結(jié)果顯示Sham-Con組和Sham-TT組大鼠運(yùn)動(dòng)功能完全正常。在SCI術(shù)后1 d和3 d，SCI-Con組和SCI-TT組的BBB評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)后7 d時(shí)，SCI-TT組大鼠BBB評(píng)分高于SCI-Con組（P＜0.05）；在SCI后14 d，與SCI-Con組相比，SCI-TT組大鼠BBB評(píng)分顯著性增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1D。

圖1 TT對(duì)大鼠SCI后組織形態(tài)和水腫的影響

2.2 TT對(duì)SCI大鼠BSCB的影響 EB染色結(jié)果顯示Sham-TT組中EB染料與Sham-Con相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在SCI后，與Sham-Con組比，SCICon組脊髓組織中的EB染料含量顯著增加（P＜0.05）。與SCI-Con組相比，SCI-TT組的大鼠脊髓組織中EB染料含量顯著減少（P＜0.05），見圖2。

圖2 EB染色和染色結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.3 TT對(duì)大鼠脊髓打擊部位周圍組織中AQP4和GFAP蛋白表達(dá)的影響 在各組中，AQP4蛋白的總表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與Sham-Con組相比，Sham-TT組中GFAP表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。SCI后，與Sham-Con組比，SCI-Con組組織中GFAP的表達(dá)量顯著上升（P＜0.05）。與SCI-Con組相比，SCI-TT組中GFAP蛋白的總表達(dá)量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組AQP4和GFAP蛋白表達(dá)情況

2.4 TT對(duì)AQP4與GFAP和CD31蛋白共表達(dá)的影響 在正常情況下，TT對(duì)于脊髓組織中AQP4與GFAP和CD31蛋白的共表達(dá)并無明顯影響。與Sham-Con組相比，SCI-Con組中AQP4與GFAP和CD31的共標(biāo)記表達(dá)增加。與SCI-Con組相比，SCI-TT組中AQP4與GFAP和CD31的共標(biāo)記表達(dá)進(jìn)一步增加，見圖4。

圖4 各組AQP4的極性表達(dá)情況

2.5 TT對(duì)AQP4蛋白極性表達(dá)的影響 在Sham組中，在星型膠質(zhì)細(xì)胞足膜與內(nèi)皮細(xì)胞的連接處可以觀察到AQP4的免疫沉淀，但Sham-TT組與Sham-Con組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與Sham-Con組相比，SCI-Con組中AQP4免疫沉淀顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與SCI-Con組相比，SCI-TT組中AQP4的沉淀量進(jìn)一步增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 各組AQP4蛋白極性表達(dá)情況

3 討論

SCI分為原發(fā)性和繼發(fā)性損傷過程[12-13]。原發(fā)性損傷是由外力引起的不可逆損傷；繼發(fā)性損傷是在原發(fā)性損傷的基礎(chǔ)上，由于脊髓水腫、出血、微管循環(huán)障礙等逐漸造成的神經(jīng)功能受損[14-15]。脊髓水腫是繼發(fā)性SCI的關(guān)鍵病理過程之一，對(duì)脊髓功能的預(yù)后恢復(fù)有重要影響[1-2]。AQP4廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是調(diào)節(jié)水通透性和水代謝的主要分子途徑，研究發(fā)現(xiàn)在成年大鼠脊髓內(nèi)有AQPs的四種亞型，其中AQP4表達(dá)量最高[7]。本研究觀察到正常大鼠或者SCI大鼠進(jìn)行TT后脊髓組織中的AQP4總蛋白表達(dá)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示SCI和跑臺(tái)干預(yù)并不會(huì)影響AQP4的表達(dá)，然而結(jié)合本研究中對(duì)組織水腫含水量的檢測(cè)結(jié)果，又提示SCI后脊髓水腫明顯增加，在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后水腫程度又減輕。這表明運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可能并不是通過直接影響AQP4的蛋白表達(dá)起到水腫減輕作用，而是通過影響AQP4的其他形式來發(fā)揮作用。

有研究發(fā)現(xiàn)SCI 2周后，當(dāng)活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞移動(dòng)到損傷區(qū)后，伴隨著AQP4的表達(dá)增加，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)慢性SCI階段AQP4表達(dá)雖增加，但神經(jīng)膠質(zhì)外側(cè)界膜的星形細(xì)胞終足膜上AQP4免疫標(biāo)記量減少，即AQP4極性表達(dá)缺失[16-17]。以往的研究及前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SCI 14 d后，AQP4主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體上，而非極性表達(dá)到星形膠質(zhì)細(xì)胞終足膜上，這延緩了水分的清除。在血管源性水腫階段，增加AQP4從星形膠質(zhì)細(xì)胞突起或胞體轉(zhuǎn)運(yùn)到血管周圍終足膜發(fā)揮水分清除作用將是減輕水腫的關(guān)鍵機(jī)制[18-19]。本研究對(duì)于大鼠SCI后AQP4在星型膠質(zhì)細(xì)胞上的極性表達(dá)進(jìn)行了探索。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在正常情況下，AQP4主要表達(dá)在星型膠質(zhì)細(xì)胞的胞體上。在正常訓(xùn)練組中也觀察到類似的AQP4表達(dá)情 況，但是兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。大鼠SCI后，我們發(fā)現(xiàn)在星形膠質(zhì)細(xì)胞足膜上的AQP4表達(dá)增加，這可能是機(jī)體對(duì)于損傷引起的水腫的自我清除作用，但這種形式的清除速度較慢，難以促進(jìn)細(xì)胞功能的恢復(fù)。

運(yùn)動(dòng)療法是一種低成本、不良反應(yīng)小的治療方法，已被證明可以促進(jìn)SCI后的恢復(fù)[20-21]。同時(shí)，水的浮力可以降低SCI大鼠向前運(yùn)動(dòng)的阻力，增加對(duì)大鼠有益的物理刺激。此外，TT的深度和速度可以調(diào)節(jié)，這便于控制運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度[22-23]。因此，本課題組使用水中跑臺(tái)對(duì)SCI大鼠進(jìn)行干預(yù)，來模擬臨床上對(duì)SCI患者的運(yùn)動(dòng)療法。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，SCI大鼠的脊髓水腫明顯減輕、組織結(jié)構(gòu)也明顯改善、在傷后7 d和14 d大鼠的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)明顯。同時(shí)，結(jié)合EB染色的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)在訓(xùn)練后，SCI大鼠BSCB的穩(wěn)定性增加，血管的滲透性得到改善。

本研究也對(duì)運(yùn)動(dòng)干預(yù)后AQP4的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，SCI后星型膠質(zhì)細(xì)胞終足端上的AQP4表達(dá)增加，對(duì)應(yīng)著胞體上的AQP4表達(dá)減少，這提示SCI后星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)AQP4可能存在某種轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，后續(xù)將進(jìn)行深入探索。同時(shí)結(jié)合Western blot結(jié)果中與SCI-Con組相比，SCI-TT組中AQP4總量表達(dá)不變的現(xiàn)象，我們推測(cè)這一結(jié)果可能是由于運(yùn)動(dòng)療法促進(jìn)了星型膠質(zhì)細(xì)胞中AQP4從胞體向足端轉(zhuǎn)移導(dǎo)致。同時(shí)，免疫電鏡檢查的結(jié)果也驗(yàn)證了這一猜想。但是我們目前無法確定AQP4在星形膠質(zhì)細(xì)胞中到底是如何轉(zhuǎn)移到足端、這種轉(zhuǎn)移是否有其他機(jī)制參與。當(dāng)然也鑒于體內(nèi)的信號(hào)分子機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，運(yùn)動(dòng)療法減輕脊髓水腫的直接分子機(jī)制還需要進(jìn)一步深入探索。

當(dāng)下用于SCI的康復(fù)治療手段雖然越來越多，但相關(guān)的機(jī)制未闡明。因此，研究康復(fù)治療手段對(duì)SCI后脊髓水腫的作用機(jī)制，對(duì)于康復(fù)治療的推廣及精準(zhǔn)康復(fù)具有重要意義。目前在SCI的相關(guān)研究中，有關(guān)AQP4極性表達(dá)在脊髓水腫方面的分子機(jī)制研究較少。本研究結(jié)果表明TT可以保護(hù)BSCB系統(tǒng)，減輕大鼠SCI后的脊髓水腫，促進(jìn)大鼠的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，其保護(hù)作用可能與促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體上的AQP4向終足端轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此推測(cè)AQP4在終足膜上的極性表達(dá)可能是TT減輕SCI后組織水腫的關(guān)鍵機(jī)制，為SCI后水腫發(fā)生發(fā)展的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。當(dāng)然，本研究也存在一些局限性。首先在這項(xiàng)研究中，團(tuán)隊(duì)只使用了雄性大鼠，忽略了性別可能造成的任何結(jié)果差異。其次，未觀察TT對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響。整體上實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)訓(xùn)練周期短，不能完全反映臨床上長期進(jìn)行運(yùn)動(dòng)康復(fù)的機(jī)體分子機(jī)制變化。在后續(xù)研究中，我們會(huì)對(duì)上述問題進(jìn)行改善，進(jìn)一步揭示運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練通過調(diào)控AQP4的極性表達(dá)減輕水腫的確切機(jī)制。