常氧和低氧條件下二甲雙胍對腦膠質瘤細胞代謝的影響

梅蕾，湯旗，厲柳岑，段榮清，沈耀

溫州醫科大學 檢驗醫學院（生命科學學院），浙江 溫州 325035

腦膠質瘤占成人惡性原發性腦腫瘤的75%，腦膠質瘤是起源于神經膠質細胞或前體細胞的神經外胚層腫瘤，包括星形細胞瘤、少突膠質細胞瘤和室管膜瘤[1]。由于腫瘤的快速和不受控制的增殖限制了O2的供給，血氧供應不足或缺氧是幾乎所有實體腫瘤的典型微環境特征，而缺氧是腦膠質瘤的一個標志，組織學上表現為偽柵欄型壞死和血管增生的病理學特征[2]。腫瘤細胞在適應缺氧的同時，導致更具侵襲性和治療耐藥性的腫瘤表型。缺氧誘導 基因表達變化和隨后的蛋白質組學變化對各種細胞和生理功能有許多重要影響，最終導致患者預后極差[3]。

二甲雙胍是雙胍家族的一員，是治療2型糖尿病最常用的口服降血糖藥物，近年來的研究發現其具有抗腫瘤作用[4]。二甲雙胍作為一種疏水性藥物，可以輕松穿過血腦屏障[5]。通過大量的臨床試 驗，已被證實二甲雙胍可以抑制白血病、胰腺癌、結腸癌、前列腺癌、卵巢癌和乳腺癌細胞的生長[6-7]， 但具體機制目前仍不清楚。本研究分析了在常氧和低氧條件下二甲雙胍對人腦膠質瘤細胞活力、增殖和代謝等的影響，為深入分析二甲雙胍在腦膠質瘤治療中的作用機制提供重要的實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：人腦膠質瘤細胞系U251購自中國典型培養保藏中心（武漢）。

1.1.2 主要試劑：二甲雙胍、MTT粉末、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所；Cell-Light EdU Apollo567 In Vitro Kit試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司；細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基生物技術股份有限公司；乳酸檢測試劑盒購自南京建成生物技術研究院；ATP檢測試劑盒（S0026）購自上海碧云天生物技術研究院；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenaseh, GAPDH）抗體（db106,Human）、肌動蛋白（beta-actin, β-actin）抗體（db13796, Human）、葡萄糖轉運蛋白（glucose transporter 1, GLUT1）抗體（db384, Human）和原癌基因（c-Myc-binding protein, c-Myc）抗體（db1667,Human）購自杭州戴格生物技術有限公司。

1.1.3 細胞培養：腦膠質瘤細胞在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）（澳洲CLARK公司）的DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）培養基（美國Gibco公司）中培養，并分別在37 ℃、6% CO2和37 ℃、1% O2、5% CO2恒溫培養箱中培養。

1.2 方法

1.2.1 細胞處理：將二甲雙胍用DMEM溶解配置成500 mmol/L濃度的溶液，給藥時用含10% FBS的DMEM培養液稀釋成25 mmol/L作用于對數生長期的腦膠質瘤U251細胞48 h。將替莫唑胺（治療腦膠質瘤的臨床藥物）用0.9%氯化鈉溶液溶解配置成200 μmol/L濃度的溶液，給藥時用培養液稀釋成 50 μmol/L作用于對數生長期的U251細胞48 h。

1.2.2 細胞分組：將腦膠質瘤U251細胞以3×103個細胞/孔接種在96孔板。細胞貼壁后，將細胞分為6個處理組進行處理，分別為A1組：常氧對照組；A2組：常氧加25 mmol/L二甲雙胍組；A3：常氧加50 μmol/L替莫唑胺組；B1組：低氧對照組；B2組：低氧加25 mmol/L二甲雙胍組；B3：低氧加 50 μmol/L替莫唑胺組。

1.2.3 MTT法檢測細胞活力：將腦膠質瘤U251細胞以3×103個細胞/孔接種在96孔板。細胞貼壁后，按照分組要求加入含有25 mmol/L二甲雙胍的完全培養液，分別放入常氧（21% O2）和低氧（1% O2）培養箱中培養48 h后，在避光條件下，按5 g/L MTT:高糖DMEM=1:9的比例配制檢測液，每孔加入100 μL檢測液后，放回培養箱孵育4 h，而后取出96孔板吸棄孔中的檢測液，每孔加入100 μL DMSO，在避光條件下，于搖床上緩慢晃動15 min。觀察到藍紫色結晶完全溶解后，利用酶標儀SpectraMax iD3（美國Thermo Fisher Scientific公司）檢測570 nm波長下的吸光度，進行統計分析。

1.2.4 平板克隆法檢測形成的細胞克隆：將腦膠質瘤U251細胞以300個細胞/孔接種在6孔板中，按實驗分組進行處理，每組3個復孔，并分別放入常氧和低氧培養箱，之后每隔3～4 d換一次液。待14 d 細胞克隆團形成之后，免疫染色固定液（4%多聚甲醛）固定15 min，用結晶紫染液染色15 min，ddH2O洗至背景清透，晾干后將6孔板水平倒置放在醫用觀片燈上固定手機的位置后拍照。用ImageJ進行細胞克隆團計數。

1.2.5 EdU細胞增殖檢測：將腦膠質瘤細胞U251以3×103個細胞/孔接種在96孔板中，每組細胞做3～6個復孔，按實驗分組進行處理，用EdU（胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶摻入正在復制的DNA分子中，通過基于EdU與Apollo熒光染料的特異性反應快速檢測DNA復制活性，可快速準確的檢測細胞的增殖能力）檢測試劑盒進行檢測后用熒光倒置顯微鏡ECLIPSE Ti（日本Nikon公司）觀察細胞染色情況并拍照記錄。

1.2.6 流式細胞術細胞周期檢測：按實驗分組對腦膠質瘤U251細胞處理后，收集6×104個細胞用碘化丙啶（propidium iodide, PI）染色20 min后通過流式細胞術分析細胞周期。

1.2.7 細胞代謝物檢測：將細胞按3×103個細胞/皿的密度種植于細胞培養大皿中，放置于培養箱培養至細胞貼壁。細胞貼壁后，按上述分組，每組6個大皿，處理48 h。在30 min紫外燈照射的超凈工作臺中使用滅菌PBS將每皿細胞洗2遍，然后使用乙醇消毒過的細胞刮刀將每組6個大皿的細胞分別收集至已滅菌的1.5 mL EP管內，4 ℃，1 000 r/min 離心20 min，棄上清，封口膜封口后放置于液氮罐中速凍5 min，然后置于-80 ℃暫存待測。稱取100 mg 的細胞樣品進行液氮研磨。然后加入120 μL 50%甲醇，充分震蕩混勻，常溫靜置10 min。將制備好的提取液置于-20 ℃過夜，使其沉淀每個樣品中的蛋白質，然后4 000×g離心20 min，將提取的上清液轉移至到96孔板。從每個樣品中取出10 μL稀釋液混合以作為質控（quality control, QC）樣品，每個細胞代謝物樣品在上樣前均放置于-80 ℃冰箱保存待用。使用超高效液相色譜（UltiMate 3000, Thermo Fisher Scientific, 美國）-質譜（Q-Exactive，Thermo Fisher Scientific, 美國）聯用儀對細胞代謝物進行檢測，對數據進行統計分析。

1.2.8 細胞ATP含量檢測：將按實驗組處理后的腦膠質瘤U251細胞的細胞皿中的培養液吸除，根據ATP檢測試劑盒的操作步驟，在6孔板中每孔加入200 μL試劑盒中的裂解液，用移液器進行反復吹打使裂解液充分接觸并充分裂解細胞。將細胞裂解液轉移到1.5 mL的EP管中后用離心機4 ℃ 12 000×g離心5 min，取上清液待用。將待用試劑在冰上融解，把ATP標準溶液用ATP檢測裂解液稀釋成0.01、 0.03、0.1、0.3、1、3和10 μmol/L的濃度。取適量的ATP檢測試劑，按照1:9的比例用ATP檢測試劑稀釋液稀釋ATP檢測試劑配成ATP工作液，在冰浴上暫時保存。在黑色的96孔板中每孔加入100 μL ATP檢測工作液，室溫放置5 min，以使本底的ATP全部被消耗掉，從而降低本底的ATP。在96孔板中每孔加入20 μL樣品和標準品，迅速用移液器混勻，至少間隔2 s后，用酶標儀中的luminometer測定RLU值，根據標準曲線計算出樣品中的ATP濃度。

1.2.9 細胞胞外乳酸含量檢測：在空白管、標準 管、測定管中分別加入10 μL的ddH2O、標準品、待測樣本。按照乳酸檢測試劑盒的操作步驟處理后，用酶標儀在波長530 nm，檢測吸光度。

1.2.10 蛋白質印跡法（Western blot）檢測GLUT1和c-Myc蛋白的相對表達量：使用RIPA緩沖液從腦膠質瘤U251細胞中提取總蛋白，對樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳法，電泳轉移到PVDF膜上。隨后，室溫下將膜在含5%脫脂牛奶的Tris緩沖液中孵育2 h，然后放入按照說明書比例稀釋的一抗管中（β-actin為1:1 000、GAPDH為1:2 000、GLUT1為1:1 000和c-Myc為1:1 000）孵育16 h。與二抗（辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG，A0208，1:1 000）孵育2 h。ECL試劑盒（上海碧云天生物技術研究所）觀察免疫印跡，并使用ImageJ軟件掃描分析，以GAPDH和β-actin為內參計算上述目標蛋白的相對表達量。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS20.0版軟件進行統計學分析。正態分布計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 常氧和低氧條件下二甲雙胍對腦膠質瘤U251細胞活力的影響 MTT實驗結果顯示：在常氧和低氧條件下，與對照組比，25 mmol/L二甲雙胍分別處理腦膠質瘤U251細胞48 h后，細胞活力均降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；相較于低氧條件下，常氧條件下25 mmol/L二甲雙胍處理腦膠質瘤U251細胞48 h后，U251細胞的活力平均降低更顯著，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖1。

圖1 二甲雙胍對腦膠質瘤U251細胞活力的影響

2.2 常氧和低氧條件下二甲雙胍和替莫唑胺對腦膠質瘤U251細胞形成克隆能力的影響 二甲雙胍在常氧和低氧條件下對U251細胞的形成克隆率分別下降至（6.01%±4.52%）和（48.50%±2.80%），而替莫唑胺在常氧和低氧條件下對U251細胞的形成克隆率分別下降至（59.56%±8.61%）和（60.15%±1.77%），50 μmol/L替莫唑胺和25 mmol/L二甲雙胍能夠明顯抑制U251細胞形成克隆（P＜0.01），且二甲雙胍對腦膠質瘤U251細胞的形成克隆能力的抑制作用更明顯（P＜0.01），見圖2。說明二甲雙胍顯著抑制了U251細胞形成克隆的能力，且常氧條件下二甲雙胍對U251細胞的形成克隆能力影響更大，這與常氧和低氧條件下25 mmol/L二甲雙胍對腦膠質瘤U251細胞活力的影響程度相同。

圖2 二甲雙胍對腦膠質瘤U251細胞形成克隆能力的影響

2.3 常氧和低氧條件下二甲雙胍對腦膠質瘤U251細胞增殖能力的影響 EdU實驗結果顯示：在常氧和低氧條件下，與對照組比，25 mmol/L二甲雙胍和50 μmol/L替莫唑胺分別處理腦膠質瘤U251細胞 48 h后EdU陽性細胞數較對照組明顯降低（P＜0.01），且常氧條件下的抑制作用更明顯（P＜0.01）。見圖3。

圖3 二甲雙胍和替莫唑胺對腦膠質瘤U251細胞增殖的影響

2.4 常氧和低氧條件下二甲雙胍對U251細胞的細胞周期的影響 細胞周期實驗結果顯示，常氧和低氧條件下，與對照組相比，二甲雙胍處理U251細胞后呈現GO/G1期阻滯，處于G0/G1期的細胞數明顯增加（P＜0.01）。見圖4。

圖4 二甲雙胍對腦膠質瘤U251細胞周期的影響

2.5 常氧和低氧條件下二甲雙胍對腦膠質瘤U251細胞代謝的影響

2.5.1 差異細胞代謝物定量結果：主成分分析（principal component analysis, PCA）圖中的每個點代表一個樣本，所有樣本之間的異同體現于圖中樣品的分離、聚集趨勢，點的聚集表示觀測變量具有高度的相似性，點的離散代表了觀測變量有明顯的差異性。通過PCA圖可以比較直觀地看出組內數據的相似性和組間數據的差異性（見圖5A）。而從差異代謝物中離子的統計來看，常氧培養條件下，對照組細胞內代謝物中離子含量上調的數值遠遠高于下調的數值，而加入二甲雙胍處理后代謝物中下調的離子數增加；而低氧培養條件下，對照組細胞代謝物中離子含量上調的數值低于下調的數值，而加入二甲雙胍后，代謝物中離子含量的變化趨勢則與之相反。這表明，在常氧和低氧條件下，二甲雙胍的確改變了腦膠質瘤U251細胞的代謝狀態（見圖5B）。差異代謝物火山圖（見圖5C、圖5D）和差異代謝物熱圖（見圖5E、圖5F）也可以得出同樣的結論。

圖5 二甲雙胍對腦膠質瘤U251細胞代謝的影響

2.5.2 差異代謝物分類統計分析：將篩選出的差異表達離子進行了分類統計分析，主要從糖代謝、氨基酸代謝、脂質代謝、核苷酸代謝四個方面進行整理。結果顯示，常氧和低氧條件下氨基酸代謝差異（見圖6A、圖6B），包括參與丙氨酸代謝、天冬氨酸代謝、谷氨酸代謝、蛋氨酸代謝、甘氨酸代謝、絲氨酸和蘇氨酸代謝等多種氨基酸代謝途徑中的氨基酸代謝物含量在經過二甲雙胍處理后含量均降低（P＜0.05），其中常氧條件下同時參與三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle, TCA）的檸檬酸鹽代謝物含量降低，而低氧條件下未發生變化。在脂質代謝方面（見圖6C），常氧條件下，二甲雙胍主要影響了細胞在甘油磷脂代謝、乙醚脂質代謝、甘油脂代謝等三個代謝途徑中的相關代謝物，其中包括sn-甘油-3-磷酸、磷酸膽堿、sn-甘油-3-磷酸膽堿、三乙醇胺、sn-甘油-3-磷酸酯等，但這些代謝物的變化趨勢并不完全一致，具體的機制還需進一步探討，而低氧條件下未發現與脂質代謝相關的代謝物的變化。在核苷酸代謝方面（見圖6D、圖6E），常氧條件下，二甲雙胍主要影響了細胞的嘌呤和嘧啶的代謝，其中包括腺苷、尿苷、腺嘌呤、肌苷等代謝物的含量均出現顯著降低（P＜0.01）；低氧條件下，二甲雙胍主要影響了細胞的嘌呤代謝，其中鳥嘌呤和脫氧腺苷代謝物的含量降低。因此，我們猜測二甲雙胍對腦膠質瘤的抑制作用可能在于抑制DNA的合成。在糖代謝方面（見圖6F），低氧條件下二甲雙胍降低了半乳糖代謝、糖酵解/糖異生、磷酸戊糖途徑中的葡萄糖-6-磷酸代謝物的含量且差異有統計學意義（P＜0.05），而在常氧條件下未發現與糖代謝相關的代謝物的變化，因此推測二甲雙胍在低氧條件下可能通過抑制糖代謝來減慢腦膠質瘤的增殖和生長。

圖6 二甲雙胍對腦膠質瘤U251細胞差異代謝物的分類統計分析

2.6 常氧和低氧條件下二甲雙胍對腦膠質瘤U251細胞ATP的影響 使用ATP檢測試劑盒檢測細胞內的ATP含量，結果顯示，常氧條件下25 mmol/L二甲雙胍處理U251細胞48 h后ATP的產生量增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；低氧條件下，25 mmol/L二甲雙胍處理U251細胞48 h后ATP的產生量下降，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖7。

圖7 二甲雙胍對腦膠質瘤U251細胞ATP含量的影響

2.7 常氧和低氧條件下二甲雙胍對腦膠質瘤U251細胞乳酸的影響 采用乳酸檢測試劑盒檢測常氧和低氧條件下25 mmol/L二甲雙胍處理U251細胞48 h 后乳酸的變化情況，結果顯示，常氧條件下二甲雙胍處理U251細胞后細胞的乳酸產生量增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；低氧條件下二甲雙胍處理U251細胞后細胞的乳酸產生量下降，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖8。

圖8 二甲雙胍對腦膠質瘤U251細胞乳酸含量的影響

2.8 常氧和低氧條件下二甲雙胍對腦膠質瘤U251細胞GLUT1和c-Myc蛋白表達的影響 Western blot檢測在常氧和低氧條件下25 mmol/L二甲雙胍處理腦膠質瘤U251細胞48 h后GLUT1和c-Myc蛋白的表達水平，結果顯示，常氧條件下25 mmol/L二甲雙胍處理U251細胞48 h后U251細胞內的GLUT1和c-Myc蛋白表達均出現上調，且GLUT1蛋白差異有統計學意義（P＜0.05）；低氧條件下25 mmol/L二甲雙胍處理腦膠質瘤U251細胞48 h后U251細胞內的GLUT1和c-Myc蛋白表達均出現下調且差異均有統計學意義（P＜0.01）。見圖9。

圖9 二甲雙胍對腦膠質瘤U251細胞GLUT1、c-Myc蛋白表達的影響

3 討論

近年來的研究表明二甲雙胍可以安全的作為抗腫瘤藥物運用于臨床。腦膠質瘤的預后較差，傳統治療目前尚無法獲得理想的治療效果[8]，因此，積極尋找改善膠質瘤預后的新的治療策略和藥物顯得尤為重要。在本研究中，我們首先評估了常氧和低氧條件下25 mmol/L二甲雙胍作用48 h的抗腦膠質瘤活性，發現二甲雙胍對人腦膠質瘤U251細胞活力具有顯著的抑制作用。腦膠質瘤隨著腫瘤細胞的不斷增殖，腫瘤內部氧氣供應不足，呈現低氧狀態。因此，當氧氣缺乏時，細胞依靠糖酵解而不是產生氧氣的線粒體代謝來提供能量。然而，即使在氧氣存在的情況下，癌細胞也更喜歡在細胞質中進行糖酵解，這一現象首先由Warburg觀察到，現在被稱為“Warburg效應”或“有氧糖酵解”[9-10]。

低氧可以說是癌癥中最具吸引力的治療靶點之一。目前已經提出了幾種靶向缺氧治療腫瘤細胞的方法，包括缺氧激活前藥物、基因治療和特異性靶向HIF（缺氧誘導因子）或靶向缺氧細胞中重要的通路，如mTOR（雷帕霉素靶蛋白）和UPR（未折疊蛋白反應）通路[11]。本研究結果顯示，二甲雙胍對低氧條件下的腦膠質瘤細胞增殖、新生及活力具有顯著的抑制作用，促進腦膠質瘤細胞細胞周期阻滯，誘導其凋亡，不會因為腫瘤微環境中氧氣濃度的改變而出現耐藥，而且常氧和低氧條件下抑制作用相似。

在許多癌癥中發現糖酵解增強的代謝特征，后來被證實癌細胞中許多與糖酵解有關的酶的蛋白水平及其活性均上調[12]。人們最初認為，癌細胞增強的糖酵解可為其提供能量，以滿足癌細胞高增殖的需求[13-14]。

為了探究二甲雙胍是否影響腦膠質瘤的糖酵解，我們對二甲雙胍處理后的腦膠質瘤細胞的代謝物進行了檢測。我們發現在常氧條件下，二甲雙胍對腦膠質瘤細胞代謝途徑的影響主要在氨基酸、脂質和核苷酸這三個代謝途徑；而在低氧條件下，二甲雙胍對腦膠質瘤細胞代謝途徑的影響除了氨基酸和脂質代謝外，還有糖代謝，能夠使腦膠質瘤細胞葡萄糖-6-磷酸代謝物含量明顯降低。有研究[15]表明，腦膠質瘤細胞高度依賴糖酵解產生ATP，且當氧氣缺乏時，細胞依靠糖酵解而不是消耗氧氣的線粒體代謝來提供能量，而糖酵解的每分子葡萄糖產生ATP的效率雖然低，但其產率要比氧化磷酸化的產率快得多，可以滿足癌細胞快速生長和增殖的需要。由于二甲雙胍是一種陽離子雙胍藥物，容易在線粒體中積累，在線粒體中它抑制電子傳遞鏈（ETC）的復合體I[16-17]。這種ETC抑制會誘導能量應激，促進腺苷單磷酸激酶（AMPK）的激活，隨后導致分解代謝，恢復能量穩態[18]。研究[19]表明，二甲雙胍減少線粒體依賴的ATP產生和氧消耗，并增加乳酸和糖酵解ATP產生，且缺氧微環境有利于促進糖酵解，增加糖酵解關鍵酶和乳酸脫氫酶A的活性繼而增加乳酸產生。為了確定二甲雙胍對腦膠質瘤細胞糖代謝的影響，我們檢測了腦膠質瘤細胞ATP和胞外乳酸的含量，發現在低氧條件下二甲雙胍對腦膠質瘤細胞的ATP和胞外乳酸的含量無明顯改變，其作用機制需要進一步研究探討；但在常氧條件下，二甲雙胍增加了腦膠質瘤U251細胞的ATP和胞外乳酸含量，一部分可能是由于二甲雙胍在線粒體中的積累導致細胞發生了能量應激，另一部分可能是通過糖酵解產生。

由GLUT蛋白介導的通過質膜轉運葡萄糖是葡萄糖代謝的第一個限速步驟[20]。在許多癌癥類型中，由于基因表達的擾動或蛋白質的重新定位或穩定，發現GLUTs的表達出現上調[15]。此外，有大量研 究[21-23]表明，GLUT1在多種癌癥中發揮關鍵作用，如肝細胞癌、乳腺癌、腎癌等，能夠促進癌細胞增殖和轉移，且抑制癌細胞凋亡。原癌基因c-Myc已被證實可促進癌細胞糖酵解[24-25]，且可以通過直接上調3-磷酸甘油醛脫氫酶、己糖激酶2和乳酸脫氫酶A等基因的表達來增強有氧糖酵解[24]。由于它們能夠維持腫瘤細胞進行各種生化程序所需的能量需求，因此它們是開發抗癌策略的有前途的靶點。

在本研究中，我們驗證了在常氧和低氧條件下，二甲雙胍對人腦膠質瘤細胞活力、增殖以及細胞周期均具有相似的影響。由于糖代謝途徑對腦膠質瘤生長和能量獲取具有重要作用，我們還發現了低氧條件下二甲雙胍對腦膠質瘤細胞的抑制作用部分歸因于抑制其糖代謝途徑，而二甲雙胍是部分通過降低葡萄糖轉運蛋白GLUT1、原癌基因c-Myc蛋白表達來發揮作用。

綜上所述，本研究結果表明，二甲雙胍可能是一種潛在的靶向抗腫瘤的藥物，可通過抑制低氧條件下人膠質瘤細胞糖代謝而減慢癌細胞的生長，但具體的機制還有待于進一步研究。