基于NLRP3炎性小體探討清心開竅方對APP/PS1雙轉基因小鼠神經炎癥的影響

王柳鶯，賴曉曉，劉碩，徐露婷，沈燕，胡海燕

1.溫州醫科大學附屬第二醫院 中醫科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫科大學 第二臨床醫學院，浙江 溫州 325035

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一種進行性晚期癡呆性疾病，漸進性認知能力下降和生活障礙，目前尚無有效的治療手段[1-2]。在β-淀粉樣蛋白（β-amyloid, Aβ）沉積的刺激下，核苷酸結合寡聚域樣受體蛋白3（Nod-like receptor protein 3, NLRP3）在AD大腦內組裝和激活，進一步引起天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白（cysteinecontaining aspartate-specific proteases-1,Caspase-1）的激活以及下游白細胞介素（interleukin,IL）-1β分泌，引發炎癥反應[3]。目前越來越多研究表明，抑制NLRP3相關通路可以影響AD的發生發 展[3-4]。清心開竅方是在經方劑服蠻煎的基礎上去木通加苦參而成，課題組以往的研究表明，清心開竅方可以多靶點抑制Aβ的生成并且能改善AD小鼠的學習記憶能力[5]。臨床觀察表明，經辨證選用服蠻煎及其他名方合并西藥治療AD，對恢復AD患者的認知功能優于單獨使用西藥[6]。APP/PS1小鼠是公認的研究AD防治策略的轉基因動物模型。鹽酸多奈哌齊片（安理申）是目前臨床運用最多的治療AD的藥物，常用于治療輕度、中度AD，故將多奈哌齊設為西藥對照組[7]。本研究旨在以APP/PS1小鼠為實驗對象，從NLRP3相關通路來探討清心開竅方對AD的神經保護作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：從上海集團醫藥生物有限公司購入3月齡的10只雄性C57BL/6J小鼠[動物許可證號：SCXK（蘇）2018-0008]。從智新（北京）健康醫學研究院有限公司購入同齡雄性SPF級的50只APP/PS1雙轉基因小鼠[動物許可證號：SCXK（蘇）2018-0002]。小鼠均飼養在溫州醫科大學SPF級別的動物房里。小鼠被安置在獨立的籠子里，在室溫（23± 2）℃和相對濕度40%～50%的條件下，保持12 h的光-暗周期，并提供充足的食物，小鼠可自由飲水飲食。實驗前先適應性飼養7 d，本研究經溫州醫科大學實驗動物倫理委員會批準（wydw2020-0814）。

1.1.2 主要試劑和儀器：清心開竅方水煎劑組 成：鮮地黃6 g、苦參6 g、白芍藥6 g、陳橘皮4 g、石斛6 g、伏神6 g、知母5 g、牡丹皮6 g、石菖蒲6 g、麥門冬6 g，由溫州醫科大學附屬第二醫院中藥房提供。鹽酸多奈哌齊藥片（安理申）購自遼寧衛材制藥有限公司（批號：100223A）。蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒購自北京索萊寶公司，甲苯胺藍染液購自北京雷根生物技術有限公司，SYBR Green I和反轉錄試劑盒購自日本Takara公司。山羊抗兔NLRP3（ab263899）、IL-6（ab7737）和Aβ（ab110888）抗體購自英國Abcam公司，山羊抗小鼠Caspase-1（14F468）抗體購自美國Santa公司，山羊抗兔IL-1β（D4T2D）購自美國Cell Signaling Technology公司，山羊抗兔Tublin購自美國Affinity公司。Morris水迷宮（Morris water maze, MWM）（北京碩林苑公司），化學發光凝膠成像儀系統、CFX 96touch熒光定量PCR（美國伯樂公司），石蠟切片機（英國Shandon公司），病理掃描儀（日本KEYENCE公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及給藥方法：將實驗小鼠按隨機數字表法分為清心開竅方高劑量（H-QKF）組 [19 mg/（kg·d）]、清心開竅方中劑量（M-QKF）組 [9.5 mg/（kg·d）]、清心開竅方低劑量（L-QKF）組 [4.75 mg/（kg·d）]、多奈哌齊（Aricept）組 [1.67 mg/（kg·d）]和APP/PS1雙轉基因模型（Model） 組，每組10只。同時選取相同數量的C57BL/6J小鼠作為對照（Control）組，向胃內灌注同體積的0.9%氯化鈉溶液。所有動物于每日上午9時進行灌胃給藥，連續進行90 d。

1.2.2 MWM實驗：定向導航測試和空間探索測試是MWM實驗的兩個主要部分。MWM由一個圓形水池（直徑160 cm，高度50 cm）組成，水溫為（25±2）℃，在第四象限不透明水面下2～3 cm處放置一個隱藏的平臺（直徑10 cm）。在水池正上方約2.5 m處設置一個與系統相連的攝像頭，用于記錄小鼠的游泳軌跡和相關數據。定向導航測試是每天上午9點進行連續5 d的訓練，一天4次，每個象限為入水處1次， 訓練間隙需超過20 min。逃避潛伏期是指老鼠進入水中并找到平臺所需的時間。小鼠到達隱藏平臺的時間限制被設定為60 s。小鼠在時限內找到平臺，并在平臺上停留3 s，就被認為是成功的，記錄對應逃避時間。如果小鼠未能在時限內到達平臺，則逃避時間被記錄為60 s，并指引小鼠在平臺上停留10 s 以加強記憶。每日4次訓練成績的平均值記錄為其逃避時間，用來評估其學習記憶能力。空間探索測試是在實驗的第6天，將水池中的平臺取出，讓小鼠自由游泳60 s，記錄其穿越平臺的次數和在目標象限的時間百分比來評估其空間位置記憶能力。

1.2.3 腦組織取材：在進行腦組織取材前，需要對小鼠進行安樂死。行為學測試結束后，將每組小鼠隨機抽樣，分為A組（36只）和B組（24只）。A組小鼠通過3%戊巴比妥鈉進行麻醉，夾住小鼠爪子測試無明顯反應后迅速處死，用鑷子將大腦剝離出來，放入標記后的無酶Ep管中，并在-80 ℃的冰箱中冰凍保存，用于后續實驗。將B組小鼠心臟灌注并取出腦組織，石蠟包埋組織，用于后期病理染色實驗。

1.2.4 HE染色：將石蠟切片（5 μm）放入烘箱2 h徹底融化組織表面殘余石蠟，接著放入二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化，隨后使用蘇木素染色3 min，超純水洗去多余染色液。顯微鏡下分化液分化5 s，用自來水沖洗5 min。然后將樣本置于伊紅染色液中 1 min，并傾倒掉多余的染色液，超純水沖洗2～3 s，后進行快速乙醇上行脫水和二甲苯透明處理，中性樹脂封片，掃描儀進行圖像采集，觀察小鼠海馬區神經元染色效果。

1.2.5 尼氏（Nissl）染色：切片常規脫蠟后，使用甲苯胺藍染色劑在60 ℃下染色30 min，然后在蒸餾水和70%乙醇中進行洗滌（各5 min）。使用95%乙醇快速分化，如果分化不成功可以重復染色步驟。隨后，使用無水乙醇快速脫水，再用二甲苯透明，中性樹脂封片，觀察小鼠海馬CA1區的尼氏體數量。

1.2.6 蛋白質印跡（Western blot）：將腦海馬組織（50～80 μg）用裂解液、磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的混合物勻漿裂解。收集上清液后，用BCA法測定蛋白質的濃度并制備蛋白質樣品。蛋白質樣品通過電泳分離并轉移到PVDF膜上。將膜在5%的脫脂牛奶中封閉2 h，并與各種抗體（1:1 000）在4 ℃冰箱搖床上孵育過夜。第2天，用TBST清洗膜，并在室溫下與對應的二抗孵育90 min。洗掉二抗用超靈敏的ECL化學發光試劑盒對條帶顯影，用Image lab軟件分析條帶的灰度值，并以Tublin為內參計算相關條帶的相對表達量。

1.2.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測：用TRIzol方法從海馬組織中分離出總RNA，用分光光度計測定RNA的純度和濃度。根據反轉錄試劑盒合成cDNA。20 μL RT-qPCR反應體系：10 μL TB Green Premix Ex Taq II，正向和反向引物 （10 μmol/L）各1 μL，6 μL不含RNase的H2O，2 μL cDNA模板；反應條件：95 ℃預變性（1個循環） 4 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，35個反應循環，72 ℃延伸10 min。每個樣本組重復實驗3次，軟件自動計算每個指標組中目標基因的Ct值，采用2-ΔΔCt法進行統計分析。引物序列見表1，由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 目的基因引物序列

1.3 統計學處理方法 采用SPSS25.0、Prism 9進行數據分析和圖表繪制。計量資料采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗或Dunnett’sT3（方差不齊）驗證。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 清心開竅方對AD模型小鼠學習和記憶的影響 在5 d的MWM定位航行試驗中，與Control組相比，Model組的運動軌跡明顯是無方向性的，而各治療組對平臺則是進行選擇性搜索，且搜索路徑比Model組明顯縮短（見圖1A）。隨著訓練時間的增加，各組的逃避潛伏期逐漸下降。在訓練的第1天，6個實驗組之間的逃避潛伏期差異無統計學意義 （P＞0.05）；第2天，Model組的平均逃避潛伏期高于Control組，差異有統計學意義（P＜0.05）；在第3天，Model組的平均逃避潛伏期高于Control組（P＜ 0.01），且Aricept組、M-QKF組和H-QKF組的逃避潛伏期比Model組明顯縮短（P＜0.05）。在訓練的第4天和第5天，Aricept組、M-QKF組和H-QKF組的逃避潛伏期都明顯短于Model組（P＜0.01），L-QKF組的逃避潛伏期也比Model組有一定程度的縮短（P＜0.05）。與Aricept組相比，L-QKF組逃避潛伏期較長，差異有統計學意義（P＜0.05），而M-QKF組和HQKF組差異無統計學意義（P＞0.05）。在3個給藥組中，M-QKF組的小鼠的逃避潛伏期比H-QKF組和L-QKF組要短。見圖1B和圖1C。各組訓練后潛伏期縮短的程度不同，說明小鼠平臺發現是一個學習和記憶的過程，治療組小鼠的學習和記憶能力都有提高。

圖1 清心開竅方對APP/PS1雙轉基因小鼠學習記憶能力的影響

在去除平臺后的空間探索測試中，Model組的小鼠在水池中無方向游動，不能有效地定位隱藏的平臺，而Control組的小鼠在訓練后能夠準確地定位平臺的隱藏位置，并多次穿越隱藏的平臺；各治療組介于兩者之間，與Model組相比能夠更好地找到隱藏平臺處，見圖1D。與Control組相比，Model組跨越平臺的次數和在平臺目標象限所花費的時間明顯減少（P＜0.01）；各藥物干預組與Model組相比，其平臺跨越次數和在平臺像限滯留時間明顯增加 （P＜0.05，P＜0.01）；見圖1E、圖1F；表明治療組小鼠對隱藏平臺所在的位置有更強的記憶保留。

2.2 清心開竅方對AD模型小鼠海馬區神經元的影響 Control組小鼠海馬CA1區中的錐體細胞排列密集、結構完整，細胞形態正常，細胞核大且形狀圓潤，沒有壞死退化的神經元，相比之下，Model組海馬中神經元數量減少（P＜0.05），結構變得緊湊無序，錐體細胞大量減少，細胞體積縮小，部分細胞出現形態學變化，細胞核固定、皺縮，細胞大量壞死，染色更深。與Model組相比，Aricept組和MQKF組細胞數量增加（P＜0.05），細胞形態更加完整，排列更加整齊緊密。在3個清心開竅方藥物劑量組中，H-QKF組和L-QKF組與Model組相比，也表現為異常細胞減少（P＜0.05），形態較為完整。與Aricept組相比，M-QKF組細胞數目增加，而H-QKF組和L-QKF組有一定減少，說明M-QKF組效果最明顯。見圖2。

圖2 小鼠海馬CA1區HE染色以及細胞數目統計圖（標尺總長=50 μm）

2.3 清心開竅方對AD模型小鼠海馬區尼氏體的影響 尼氏體是一種嗜堿性顆粒，經甲苯胺藍染色后呈深藍色，是神經元細胞合成蛋白質的主要場所，在神經元興奮傳導過程中具有重要作用，可以評估神經元功能狀態。本研究中小鼠海馬的Nissl染色結果顯示，在Control組小鼠的海馬區，神經元呈多層密集排列，形態規則，胞核染色深藍色，富含尼氏體。然而，Model組小鼠海馬區神經元的排列明顯散亂，間隙變大，尼氏體數量減少（P＜0.05），胞核染色變淺。Aricept組、L-QKF組、M-QKF組和HQKF組神經元的排列與Model組相比有所改善，神經元排列整齊，尼氏體數量增多（P＜0.01），染色加深。藥物干預組之間比較，M-QKF組尼氏體數目與Aricept組差異無統計學意義（P＞0.05），而L-QKF組略有降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 小鼠海馬CA1區Nissl染色及尼氏體數目統計圖（標尺總長=50 μm）

2.4 清心開竅方對AD模型小鼠海馬區NLRP3、 Caspase-1、Aβ、IL-1β、IL-6蛋白表達的影響 NLRP3、 IL-1β、Aβ、Caspase-1和IL-6在各組小鼠的海馬組織中均有表達。與Control組相比，Model組NLRP3、IL-1β、Aβ、Caspase-1和IL-6的蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.01）；與Model組相比，藥物干預組蛋白NLRP3、Caspase-1、Aβ、IL-1β和IL-6的蛋白相對表達量均有不同程度的降低（P＜0.05）；與Aricept 組相比，M-QKF組Caspase-1、Aβ、IL-1β和IL-6的蛋白相對表達量差異無統計學意義（P＞0.05），NLRP3蛋白表達量更低（P＜0.05），而L-QKF組的Aβ、IL-1β、IL-6蛋白表達量有所升高（P＜0.05）。見圖4。以上結果表明藥物干預對模型小鼠炎性反應有明顯的抑制作用。

圖4 各指標代表性Western blot條帶以及各組小鼠Aβ、NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-6蛋白表達水平

2.5 清心開竅方對AD模型小鼠海馬區NLRP3、 Caspase-1、Aβ、IL-1β、IL-6 mRNA的表達影響 與Control組相比，Model組海馬區組織NLRP3、IL-6、Aβ、Caspase-1、IL-1β的mRNA表達明顯升高（P＜0.01）；與Model組相比，Aricept組和清心開方治療組海馬中Aβ、NLRP3、IL-6、Caspase-1、IL-1β的mRNA表達有不同程度的下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。與Aricept組相比，M-QKF組和H-QKF組NLRP3、Caspase-1、Aβ、IL-1β、IL-6 mRNA的表達量差異無統計學意義（P＞0.05），而L-QKF組的Aβ、NLRP3、IL-1β、IL-6 mRNA表達有所升高（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組小鼠Aβ、NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-6 mRNA表達水平

3 討論

AD是目前最常見的神經退行性疾病之一，它是一種復雜的、多因素的疾病。根據2020年的一項全國橫斷面研究，中國有983萬60歲及以上的人患有AD[8]。全球AD患者約為5 000萬人，預計到2050年將增加兩倍[9]。在中國老齡化現象日益加劇的情況下，AD的患病人數也會增加，給國家醫療衛生帶來巨大考驗，也會給家庭經濟帶來巨大負擔[10]。

盡管AD患者的醫療負擔很重，但臨床上還沒有預防或逆轉該疾病的方法。目前在中國被批準用于治療AD的藥物包括乙酰膽堿酯酶 （Acetylcholinesterase, AChE）抑制劑，其中主要是多奈哌齊、利瓦斯蒂明等[11]。這些藥物對AD的癥狀改善作用十分輕微，而且有許多不良反應。中藥是中國最偉大的財富之一，因為它具有系統性、多靶點、不良反應少等特點，在預防和治療許多疾病方面發揮了良好的作用。明代名醫張景岳在《景岳全書》首次提出“癡呆”這一病名，并對該病進行了系統性的論述。他也首創“服蠻煎”，指出此方對消除氣滯、開郁結、揚正氣、馴邪氣都有很好 的效果[12]。本研究以清心開竅方作為中藥干預組，通過加減《景岳全書》中的經方“服蠻煎”形成，去掉具有腎毒性的木通，加入具有清熱解毒作用的苦參[13]。臨床上常用于預防和治療癡呆癥的中藥有生地黃、石菖蒲、苦參等，它們是清心開竅方的主要組成部分。鮮地黃中的活性分子醇（Catapol）具有跨越血腦屏障的能力，具有明顯的神經保護、抗炎和抗衰老作用，不良反應少，可以治療AD[14]。藥理研究表明，β-細辛醚是石菖蒲的主要活性成分，β-細辛醚和淫羊藿苷的組合能有效地促進自噬，防止線粒體損傷，抑制Aβ的產生，在一定程度上治療AD[15]。苦參堿能抑制Aβ誘導的小膠質細胞活化，減少神經炎癥[16]。清心開竅方經過藥理網絡分析后發現，其所含的10種草藥中共鑒定出295種活性化合物，關聯1 368個目標蛋白質，并鑒定出與AD相關的1 218個靶基，研究結果表明，清心開竅方可通過抑制p38 MAPK和激活ERK1/2來抑制神經元的凋亡[17-18]。清心開竅方還可以通過PI3K/Akt途徑改善AD小鼠的認知能力并抑制細胞凋亡，并對APP/PS1雙轉基因動物發揮神經保護作用[19]。清心開竅方水煎劑和活性提取物能抑制神經炎癥，保護神經元細胞，從而改善AD小鼠的空間學習能力和記憶表現。

MWM實驗是全世界公認的行為學研究的經典實驗，成為學習和記憶研究的首選。本研究行為學結果顯示，經過5 d的連續訓練，小鼠的定位能力和空間探索能力得到了明顯提高，表明清心開竅方可以提高小鼠的學習和記憶能力。海馬是AD患者第一個受到影響和改變的腦區，它已被證明與AD患者的認知障礙密切相關[20]。有研究對AD大腦海馬角四個區域（CA1-CA4）的神經元密度進行量化，結果表明與其他3個區域相比，在CA1區的神經元密度減少最顯著[21]。有研究證明CA1區參與小鼠學習及空間記憶[22]。因此，在本研究中，我們把海馬CA1區作為監測AD模型小鼠神經元病理變化的目標部位。HE染色和Nissl染色表明小鼠海馬CA1區域的神經元在對照組明顯排列緊密，細胞結構完整，尼氏體含量豐富；而模型組則排列散亂，出現細胞皺縮死亡，尼氏體大量消失，Nissl染色顏色很淺；藥物治療組對比模型組均有不同程度的改善，說明清心開竅方對小鼠海馬區神經元具有保護作用，可以減少神經元的丟失。

神經炎癥是AD的一個核心機制，也是一個潛在的治療目標。Aβ在AD的神經變性中起著重要作 用[23]。在神經炎癥期間，由Aβ引發星形膠質細胞和小膠質細胞的活化并產生炎癥因子和神經毒素，促進AD大腦的神經變性[24]。本研究采用Western blot和RT-qPCR檢測Aβ斑塊的改變，表明清心開竅方可以降低Aβ的產生，從而緩解AD。NLRP3炎性小體是目前已知較特征性的炎性小體，它在小膠質細胞中表達豐富，同時有研究發現NLRP3炎性小體在引發膠質細胞反應和Aβ病理變化中發揮著重要作用[25]。NLRP3炎性小體的激活對腦組織造成重大損害，并在AD的發展中起重要作用[26]。有研究證明小鼠大腦內NLRP3敲除會明顯減少腦內Caspase-1和IL-1β激活以及增強了Aβ的清除，并可以減緩小鼠空間記憶喪失和其他AD相關癥狀[27]。有研究表明，MCC950作為NLRP3靶向分子抑制劑可以減輕AD小鼠認知障礙，抑制小膠質細胞的激活和Aβ的沉積[28]。 Aβ、膠質細胞和NLRP3炎性小體不斷相互作用，刺激神經炎癥物質的分泌，導致神經炎癥，最終導致AD的發生。以上研究表明抑制NLRP3相關通路可能是治療AD的一個新手段。本研究表明清心開竅方可以降低AD模型的NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-6的蛋白表達和NLPR3、Caspase-1、IL-1β、IL-6 mRNA的表達。清心開竅方可能可以通過抑制NLRP3炎性小體減輕AD小鼠的神經功能障礙，從而對AD產生神經保護作用。多奈哌齊被認為是治療AD的一線藥物，是第二代AChE抑制劑，可從胃腸道緩慢吸收[7]。有研究表明，多奈哌齊可抑制脂多糖誘導的AKT/MAPK信號的磷酸化、NLRP3炎性小體和轉錄因子NF-κB/STAT3，從而減少神經炎癥反應[29]。因此，本研究通過與西藥對照組的多奈哌齊的療效比較，評價清心開竅方治療AD的療效。研究結果表明，多奈哌齊能很好地抑制轉基因小鼠的病變，而清心開竅方中劑量與其效果無明顯差異，有時甚至更好，說明清心開竅方能對AD發揮良好的治療作用。因為多奈哌齊作為AChE抑制劑的作用機制是通過抑制與學習和記憶有關的神經遞質AChE的分解來改善AD[30]。然而，AChE也存在于身體的其他地方，服用這類西藥會導致一些不良反應，包括嘔吐、腹瀉、肌肉疼痛、頭痛、失眠和心律失常等[31]。研究報告說明使用多奈哌齊治療AD，隨著劑量的增加，其療效沒有明顯增強，但是會有更多更強烈的不良反應，這導致許多患者會停止治療[32]。而清心開竅方作為中藥復方對疾病可以多靶點地發揮治療作用，更適合治療病因與發病機制復雜的AD。同時各藥物組成之間相互補充，調節全身機體，有更好的療效，且不良反應很小，使患者能更專注于服藥。

綜上所述，清心開竅方能夠改善APP/PS1小鼠學習記憶能力和病理損傷，對海馬神經元起保護作用，緩解AD模型小鼠的病程進展，其機制可能是下調了NLRP3炎性小體相關的信號通路指標的表達水平，起到了抗炎的作用。清心開竅方有望在AD的臨床治療中發揮潛在的預防和治療作用。