大葉藻無(wú)菌苗快速培育試驗(yàn)

王利芹，劉延嶺，崔翠菊，田萍萍，李言

（山東東方海洋科技股份有限公司，山東 煙臺(tái) 264000）

大葉藻（Zostera marina L.）地方名為海馬藺、海帶草、海苫房草，分布于我國(guó)河北、山東等省沿海地區(qū)，在朝鮮、日本、俄羅斯、歐洲、北美洲等也有分布，通常在沿海潮間帶和潮下帶較淺的水域形成大片單種群落。大葉藻屬于單子葉植物綱（Monocotyledoneae），眼子菜科（Potamo-getonaceae），大葉藻屬（Zostera），是一種營(yíng)沉水生活的海洋高等植物，廣泛分布在近海生態(tài)系統(tǒng)中，在海洋生態(tài)環(huán)境保護(hù)中起著重要的作用[1]。近幾十年來(lái)，由于許多人為因素的干擾，海水中懸浮顆粒物質(zhì)和可溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)增多，導(dǎo)致大葉藻自然資源衰退，大葉藻植被大量減少，其種群分布范圍日益縮小。目前，大葉藻的生物特性、種子萌發(fā)等逐漸成為研究熱點(diǎn)之一[2]。

由于大葉藻種子在不利環(huán)境下具有休眠的特性，休眠時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)1 年甚至數(shù)年之久[3]。將大葉藻種子采集后直接播種或者播散到海區(qū)，由于種子休眠而不能立即進(jìn)入萌發(fā)狀態(tài)，雖然種子在休眠期間，能夠順利度過(guò)不利萌發(fā)的環(huán)境，但同時(shí)也增加被生物吞食的概率。另外由于種子休眠后再萌發(fā)時(shí)間的不確定性，也使種子萌發(fā)不能同步進(jìn)行，從而造成種子大量損失[4]。若能使休眠的大葉藻種子同步發(fā)育，并加速萌發(fā)，可以快速地獲得大量大葉藻苗。

本試驗(yàn)旨在能夠快速高效和低成本地培育大葉藻無(wú)菌苗。將種子先進(jìn)行消毒處理后，利用低鹽人工海水和鹽度升高馴化，快速打破大葉藻種子的休眠，再用滅菌海水來(lái)培養(yǎng)萌發(fā)的種子，使種子迅速萌發(fā)并且正常發(fā)育，實(shí)現(xiàn)種子的同步萌發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料

大葉藻種子、滅菌海水、蒸餾水、人工海水素、培養(yǎng)皿、吸水紙、鑷子、75%乙醇、1.5%的碘化鉀（KI），無(wú)菌操作臺(tái)和恒溫光照培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 消毒

（1）選取形狀完整、質(zhì)地堅(jiān)硬、顆粒飽滿、成熟并具有活力的大葉藻種子，用鑷子夾住種子，于常溫滅菌天然海水中依次涮洗2～3 次，直到?jīng)]有明顯的附著物和雜質(zhì)，用吸水紙吸干，移至無(wú)菌室超凈工作臺(tái)上；

（2）用75%乙醇浸泡10 min，再用滅菌天然海水涮洗2 次，用吸水紙吸干；

（3）將種子移至1.5%的KI 中浸泡20 min，再用滅菌海水涮洗2 次，用吸水紙吸干備用。

1.2.2 低鹽度海水配置

采用人工海水素和蒸餾水配制人工海水。在1 000 mL 蒸餾水中加入約5 g 人工海水素，配制成鹽度約為0.5%的人工海水（蒸餾水與海水素的質(zhì)量比例約為200∶1）。具體鹽度人工海水的配制方法，可參照下面公式計(jì)算求得：

式中：S為鹽度值，%；m為1 000 mL 純水當(dāng)中需要加入人工海水素的質(zhì)量，g。向1 000 mL 純水中加入質(zhì)量為m的海水素，所得海水鹽度即為S%。

1.2.3 光照培養(yǎng)

將上述消毒處理好的種子，接種到鹽度為0.5%的滅菌海水中，放入恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)，在溫度15 ℃、濕度60%、光照強(qiáng)度40 μmol/m2·s 條件下（L∶D=12∶12）（L：亮光時(shí)長(zhǎng)；D：暗光時(shí)長(zhǎng)）培養(yǎng)。

1.2.4 鹽度馴化

分別配制鹽度為0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%和3%的人工海水，每天提高鹽度0.5%，直至達(dá)到3%的自然海水鹽度，對(duì)萌發(fā)的種子進(jìn)行“鹽度升高馴化”；同時(shí)開展自然海水鹽度對(duì)比試驗(yàn)，自然海水的鹽度約為3%。

2 結(jié)果與分析

正常成熟的種子1～2 周內(nèi)，可以實(shí)現(xiàn)完全萌發(fā)，3 周萌發(fā)的種子的子葉長(zhǎng)度＞1 cm，發(fā)育一切正常。種子萌發(fā)1 周后，轉(zhuǎn)接到3%的滅菌海水中，在溫度15℃、濕度60%、光照強(qiáng)度40 μmol/m2·s 條件下（L∶D=12∶12）培養(yǎng)。1～2 周后萌發(fā)的種子的子葉長(zhǎng)度可達(dá)2～3 cm。鹽度0.5%種子試驗(yàn)組萌發(fā)狀態(tài)見圖1（a）（b）（c）（d）；鹽度3%種子試驗(yàn)組萌發(fā)狀態(tài)見圖2（a）（b）。

圖1 鹽度0.5%種子試驗(yàn)組萌發(fā)狀態(tài)

圖2 鹽度3%種子試驗(yàn)組萌發(fā)狀態(tài)

挑選合適的種子，經(jīng)消毒后，接種到鹽度0.5%人工海水的培養(yǎng)皿中[圖1（a）]，轉(zhuǎn)入恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)，在溫度14℃、光照強(qiáng)度40 μmol/m2·s、光暗周期L∶D=12∶12 條件下，進(jìn)行種子孵化。3 d后，低鹽海水中試驗(yàn)的種子萌發(fā)[圖1（b）]；經(jīng)過(guò)2 周時(shí)間低鹽度0.5%試驗(yàn)組大葉藻子葉已長(zhǎng)至1 cm 以上[圖1（c）]；轉(zhuǎn)移至正常鹽度海水，正常海水中又培養(yǎng)一周后的無(wú)菌苗[圖1（d）]。開展自然海水鹽度對(duì)比試驗(yàn)，對(duì)照組自然海水鹽度培養(yǎng)的種子一直未見萌芽跡象，處于休眠狀態(tài)[圖2（a）（b）]。

3 結(jié)語(yǔ)

利用低鹽度人工海水和鹽度升高馴化，打破大葉藻種子的休眠，使種子快速進(jìn)入萌發(fā)生長(zhǎng)階段，低鹽促萌發(fā)耗時(shí)短，效率高。培養(yǎng)過(guò)程只需用自然的滅菌海水即可，不需用額外的培養(yǎng)基和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，節(jié)約成本，操作簡(jiǎn)便。