反相HPLC 快速測(cè)定全反式維生素A 含量的方法探究

◎ 溫愷嘉，王小妹，林元亨，許文東，韓亞明，袁 誠(chéng)，梁北梅，黃曉玲，武林賀，盧嘉頡

（1.廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司，廣東 廣州 510240；2.中藥制藥過(guò)程技術(shù)與新藥創(chuàng)制國(guó)家工程研究中心，廣東 廣州 510240；3.廣東省藥用脂質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510240）

維生素A（視黃醇）是一種脂溶性的維生素，具有多種生理功能，其對(duì)視網(wǎng)膜、皮膚組織及人體骨骼發(fā)育、男性精子的形成和胎兒生長(zhǎng)發(fā)育、改善貧血以及提高免疫力等方面具有良好的作用，因此被廣泛應(yīng)用到各種配方食品中[1-4]。維生素A 的性質(zhì)不穩(wěn)定[5]，不利于存放或加工，所以市售的維生素A 原料多數(shù)以醋酸酯或棕櫚酸酯形式存在，因其穩(wěn)定性較佳，被廣泛應(yīng)用到含維生素A 的特殊食品加工中。維生素A 棕櫚酸酯主要通過(guò)復(fù)雜的反應(yīng)與合成過(guò)程制得，以反式結(jié)構(gòu)為主，同時(shí)伴隨少量的順式結(jié)構(gòu)，但具有活性的僅有反式結(jié)構(gòu)[6]，順式異構(gòu)體不具有活性，這表明只有準(zhǔn)確測(cè)定出樣品的全部反式維生素A 含量，才能準(zhǔn)確表達(dá)維生素A 的含量。

目前，市售的維生素A 棕櫚酸酯原料主要以全反式構(gòu)型存在，因生產(chǎn)反應(yīng)條件苛刻，生產(chǎn)過(guò)程會(huì)產(chǎn)生少量順式異構(gòu)體，這導(dǎo)致含維生素A 的成品均不可避免地含有少量順式異構(gòu)體。

目前，關(guān)于全反式維生素A 及其順式異構(gòu)體檢測(cè)的相關(guān)文獻(xiàn)較少，研究者利用正相色譜系統(tǒng)分離維生素A 的順?lè)串悩?gòu)體[7-10]。采用反相液相色譜（Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography，RP-HPLC）測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)如GB 5009.82—2016[11]中規(guī)定的色譜條件，其維生素A 的順、反異構(gòu)體的分離度低，無(wú)法達(dá)到基線分離，且該方法中樣品前處理是經(jīng)過(guò)水解、皂化、萃取、分離、回收、定容等步驟制得游離態(tài)的維生素A 再進(jìn)行測(cè)定，其操作步驟多且煩瑣，耗時(shí)長(zhǎng)且準(zhǔn)確度差。本文以含維生素A 棕櫚酸酯的維生素預(yù)混料與全營(yíng)養(yǎng)乳為研究對(duì)象，針對(duì)現(xiàn)有的全反式維生素A 測(cè)定缺陷，通過(guò)對(duì)樣品前處理及色譜條件的反復(fù)探索、測(cè)試、確認(rèn)，建立了反式維生素A 含量測(cè)定的方法，該方法簡(jiǎn)單、精密度高、準(zhǔn)確度好。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全營(yíng)養(yǎng)乳，廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司實(shí)驗(yàn)室自制；維生素預(yù)混料（含維生素A 棕櫚酸酯的原料）；乙腈、異丙醇，色譜純，Sigma 公司；正己烷、無(wú)水乙醇，分析純，廣東光華科技股份有限公司；維生素A 棕櫚酸酯對(duì)照品，Sigma 公司，批號(hào)為MKCM3866。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（Thermo U3000），美國(guó)賽默飛公司；電子天平，日本島津公司，AP225WD；振蕩器，美國(guó)艾卡公司，VIBRAX-VXR。

1.3 方法

1.3.1 樣品溶液的制備

液體樣品精密稱(chēng)取10 g，置于100 mL 的具塞試管中；固體樣品精密稱(chēng)取0.5 ～2.0 g，并加入純水10 mL使固體溶解，置于100 mL 的具塞試管中。精密加入正己烷20.0 mL，塞上塞子，置于振蕩器上，以2 000 r·min-1振蕩處理6 min，振蕩完畢加入無(wú)水乙醇20 mL，再次以2 000 r·min-1處理2 min，開(kāi)塞釋放氣體后再蓋上塞子，靜置直到溶液分層，精密吸取上清液5.0 mL，40 ℃氮吹至干，以2.0 mL 異丙醇復(fù)溶殘?jiān)^(guò)濾，即得。

1.3.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液

稱(chēng)取維生素A 棕櫚酸酯對(duì)照品50 mg，加入5 mL正戊烷溶解固體后，以異丙醇稀釋至50 mL，得濃度約為1 mg·mL-1（1 810 IU·mL-1）的對(duì)照品儲(chǔ)備液，按要求標(biāo)定其含量。

1.3.3 對(duì)照品的標(biāo)定

（1）對(duì)照品標(biāo)定液制備。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.8 mL，以異丙醇稀釋至100 mL，得濃度為8 μg·mL-1（14.5 IU·mL-1）的對(duì)照品標(biāo)定液[12]。

（2）測(cè)定。取標(biāo)準(zhǔn)品校正液適量，采用紫外分光光度法，在200 ～400 nm 處掃描，確定標(biāo)準(zhǔn)液的最大吸收峰在326 nm 附近。若測(cè)定值符合規(guī)定，則再次測(cè)定校正液分別在300 nm、326 nm、350 nm以及370 nm的吸光度值，分別計(jì)算另外3 個(gè)不同波長(zhǎng)下的吸光度與326 nm 處吸光度之比，見(jiàn)表1。

表1 不同波長(zhǎng)的吸光度比值表

若上述標(biāo)定有一項(xiàng)不符合規(guī)定，則應(yīng)更換另外批號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)品，重新進(jìn)行校正，符合要求的，依據(jù)公式（1）計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品中維生素A 棕櫚酸酯含量，維生素A 棕櫚酸酯國(guó)際單位1 IU=0.550 μg。

式中：ω1為維生素A 棕櫚酸酯含量，μg·g-1；A326為標(biāo)準(zhǔn)品校正液在326 nm 處的吸光度；1 900 為維生素A 棕櫚酸酯吸光度與含量（IU）的換算系數(shù)；V為溶液的稀釋倍數(shù)；m為對(duì)照品的質(zhì)量，g；100 為換算系數(shù)。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液

精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液，利用異丙醇稀釋2 倍，利用標(biāo)定的含量計(jì)算其溶液濃度，得濃度約為10 μg·mL-1的對(duì)照品中間液。取該溶液，再以異丙醇依次稀釋?zhuān)脴?biāo)準(zhǔn)曲線溶液1 ～5，該標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液中含維A 棕櫚酸酯的濃度依次為0.4 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、4.0 μg·mL-1和10.0 μg·mL-1。

1.4 色譜條件

色譜柱：安捷倫HC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-異丙醇（95 ∶5）；運(yùn)行時(shí)間：50 min；流速：2.0 mL·min-1；柱溫：27 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：325 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.5 測(cè)定與計(jì)算

按色譜條件依次進(jìn)樣，記錄色譜圖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品溶液含維生素A 棕櫚酸酯的濃度，并根據(jù)保留時(shí)間進(jìn)行定性，按公式（2）求出反式維生素A的含量。

式中：X為樣品中反式維生素A（以視黃醇計(jì)）的含量，μg/100 g；ρ為樣品溶液中反式維生素A 棕櫚酸酯的濃度，μg·mL-1；V為樣品溶液的稀釋倍數(shù)；m為試樣質(zhì)量，g；100 為換算系數(shù)；0.545 8 為轉(zhuǎn)換因子（維生素A 與維生素A 棕櫚酸酯分子量的比值）。

2 結(jié)果與分析

2.1 正相色譜與反相色譜法的選擇

高效液相色譜法中，正相色譜使用的常用固定相為硅膠與氰基鍵合硅膠等極性的化學(xué)鍵合固定相，使用過(guò)程易受污染，根據(jù)其特性，不宜使用含水的高極性溶劑沖洗，導(dǎo)致使用壽命短，檢測(cè)成本高，不利于推廣應(yīng)用[13]。反相液相色譜流動(dòng)相采用極性或中等極性溶劑，對(duì)儀器與色譜柱性能要求相對(duì)較低，在實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用更廣。

2.2 提取溶劑及使用量的考察

正己烷與乙醇能在一定比例下互相溶解，不利于目標(biāo)物轉(zhuǎn)移至正己烷層，因此需考察二者比例。稱(chēng)取全營(yíng)養(yǎng)乳樣品約10 g，置于100 mL 具塞試管里，精密量取并加入正己烷20 mL，利用振蕩器以2 000 r·min-1條件處理6 min，平行制備3 份。3 份樣品分別加入無(wú)水乙醇10 mL、15 mL、20 mL，其余操作與“1.3.1”項(xiàng)所述一致。根據(jù)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，無(wú)水乙醇為10 mL 添加量時(shí)，樣品溶液呈乳化狀無(wú)法分層；為15 mL 添加量時(shí)，樣品溶液分層時(shí)間大于20 min；為20 mL 添加量時(shí)，樣品溶液分層時(shí)間約為10 min。由此得出，當(dāng)正己烷-無(wú)水乙醇添加量的比例為1∶1時(shí)，樣品分層效果最好。

2.3 色譜條件的選擇

通過(guò)多組實(shí)驗(yàn)比較，得出乙腈-異丙醇系統(tǒng)較適合用于維生素A 棕櫚酸酯及其異構(gòu)體的分離，具體研究的流動(dòng)相色譜條件見(jiàn)表2。當(dāng)乙腈的比例≥95%時(shí)，與異構(gòu)體峰分離度大于1.5，兩個(gè)異構(gòu)體峰能實(shí)現(xiàn)基線分離，取主峰保留時(shí)間與分離度兩者作為選擇條件，條件2 為最佳條件。

表2 流動(dòng)相比例考察結(jié)果表

2.4 C18 色譜柱的選擇

按“1.4 項(xiàng)”色譜條件所述，筆者隨機(jī)取7 款市售C18柱對(duì)樣品的系統(tǒng)適用性進(jìn)行考察，具體見(jiàn)表3。

表3 色譜柱考察結(jié)果表

序號(hào)3 的安捷倫HC-C18色譜柱適用于維生素A 棕櫚酸酯及其異構(gòu)體的分離，分離度最優(yōu)。而GB 5009.82—2016分離全反式維生素A 及其異構(gòu)體無(wú)法分離，具體見(jiàn)圖1。

圖1 國(guó)標(biāo)法測(cè)定維生素A 圖譜

2.5 系統(tǒng)適用性與專(zhuān)屬性試驗(yàn)

按照“1.3.1 項(xiàng)”所述的方法，取全營(yíng)養(yǎng)乳、維生素A 棕櫚酸酯原料分別制備全營(yíng)養(yǎng)乳樣品溶液、維生素預(yù)混料樣品溶液；按劉華英[14]所述，取全反式維生素A 棕櫚酸酯儲(chǔ)備液，加入碘-乙醇液（2 mg·L-1），混勻，置日光燈下30 min 以上，即得到維生素A 棕櫚酸酯異構(gòu)體轉(zhuǎn)化溶液。精密吸取異丙醇與上述溶液各20 μL，根據(jù)“1.4 項(xiàng)”所述色譜條件進(jìn)樣，考察樣品溶液的專(zhuān)屬性，測(cè)定結(jié)果如圖2 所示，表明在該條件下，異丙醇對(duì)主峰測(cè)定無(wú)干擾，順、反式維生素A 棕櫚酸酯主峰基線分離，對(duì)照液與樣品溶液主峰保留時(shí)間一致。

圖2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)圖譜

2.6 線性關(guān)系考察

按“1.3.2、1.3.3、1.3.4 項(xiàng)”所述制備維生素A棕櫚酸酯標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按擬定條件進(jìn)樣，每一份濃度的溶液連續(xù)進(jìn)樣3 次，以維生素A 棕櫚酸酯濃度（μg·mL-1）作X軸，峰面積取均值后作Y軸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.736 6X-0.044 8，R2為1.000 0，表明在反式維生素A 棕櫚酸酯濃度為0.4 ～10.0 μg·mL-1時(shí)，方法線性良好。

2.7 精密度試驗(yàn)

取全營(yíng)養(yǎng)乳樣品，依據(jù)“1.3.1 項(xiàng)”所述方法處理樣品，進(jìn)行精密度試驗(yàn)，包括重復(fù)性與中間精密度。其中重復(fù)性結(jié)果以反式維生素A 計(jì)，為69.33 μg/100 g（n=6），RSD 為1.5%；中間精密度結(jié)果以反式維生素A 計(jì)，為66.04 μg/100 g（n=6），RSD 為1.5%。12 份樣品的反式維生素A 平均值為67.69 μg/100 g（n=12），RSD 為3.1%，結(jié)果表明方法的精密度良好。

取維生素預(yù)混料（含維生素A 棕櫚酸酯的原料）樣品，按“1.3.1 項(xiàng)”所述方法處理樣品，進(jìn)行精密度試驗(yàn)，包括重復(fù)性與中間精密度。其中重復(fù)性結(jié)果以反式維生素A 計(jì)，為85.04 mg /100g（n=6），RSD 為1.8%；中間精密度結(jié)果以反式維生素A 計(jì)，為86.71 mg/100 g（n=6），RSD 為1.3%。12 份樣品的反式維生素A 平均值為85.86 mg/100g（n=12），RSD 為2.5%，結(jié)果表明方法的精密度良好。

2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取全營(yíng)養(yǎng)乳樣品、維生素預(yù)混料（含維生素A 棕櫚酸酯的原料），分別進(jìn)行維生素A 棕櫚酸酯加標(biāo)回收試驗(yàn)，具體結(jié)果見(jiàn)表4。全營(yíng)養(yǎng)乳樣品在80%、100%、120%的平均回收率依次為103.5%、106.6%、105.0%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.6%、1.8%、2.0%；維生素預(yù)混料樣品在80%、100%、120%的平均回收率依次為100.2%、100.6%、99.2%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.5%、0.9%、0.4%，二者RSD 均小于3%，符合測(cè)定的準(zhǔn)確度要求。

表4 加樣回收試驗(yàn)數(shù)據(jù)表

2.9 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取全營(yíng)養(yǎng)乳樣品與維生素預(yù)混料樣品，依據(jù)“1.3.1項(xiàng)”所述分別制得樣品溶液1 份，在0 h、4 h、8 h、12 h、18 h、24 h 的時(shí)間點(diǎn)上，將該溶液在按照“1.4 項(xiàng)”所述的色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣，其峰面積RSD分別為0.4%與0.8%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 耐用性試驗(yàn)

通過(guò)改變色譜條件單因素條件（如不同柱溫、流速、流動(dòng)相比例，以及選用同一類(lèi)型但不同批號(hào)的色譜柱共7 個(gè)條件），分別對(duì)全營(yíng)養(yǎng)乳樣品與維生素預(yù)混料樣品進(jìn)行含量測(cè)定。比較原始條件及經(jīng)過(guò)微小改變的7 個(gè)單因素色譜條件的測(cè)定結(jié)果，其RSD 均小于3%。表明當(dāng)色譜條件微小變動(dòng)，對(duì)反式維生素A 測(cè)定結(jié)果的影響不大。

2.11 含量測(cè)定

取10 批廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司實(shí)驗(yàn)室自制的全營(yíng)養(yǎng)乳樣品、2 批市售的特醫(yī)食品以及3 批維生素預(yù)混料，按上文所述條件分別操作，測(cè)定樣品中全反式維生素A 的含量，具體結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 反式維生素A 含量測(cè)定結(jié)果表

3 結(jié)論

本文針對(duì)目前技術(shù)對(duì)食品中的全反式維生素A 測(cè)定存在的測(cè)定步驟多、前處理耗時(shí)長(zhǎng)、準(zhǔn)確性低且色譜分離效果不佳等問(wèn)題，建立了一種反相高效液相色譜法測(cè)定全反式維生素A 含量的方法。分別對(duì)樣品制備的溶劑、提取的手段以及色譜條件進(jìn)行反復(fù)探索、測(cè)試，并通過(guò)一系列的線性、精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性與耐用性的考察，使目標(biāo)成分與其他組分能較好分離，測(cè)得結(jié)果準(zhǔn)確可靠。在小試工藝或配方篩選時(shí)，可作為分析全反式維生素A 的快速檢驗(yàn)手段，對(duì)各類(lèi)產(chǎn)品中反式維生素A 含量的測(cè)定具有指導(dǎo)性作用。