PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6在高級別漿液性卵巢癌組織中的表達及其意義

張萍 馬嵐 陳樺

(1 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266071;2 臨沂市平邑縣中醫(yī)院病理科;3 青島市市立醫(yī)院病理科)

卵巢癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一,其發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌［1］,患者5年生存率低于45%。近年來,全球卵巢癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢［2］。卵巢癌分為不同的組織學(xué)亞型,這些亞型在細(xì)胞起源、分子模式和臨床特征上有所不同。最常見的亞型是高級別漿液性卵巢癌(high grade serous ovarian cancer,HGSOC),其也是卵巢癌患者死亡率較高的亞型之一［3］。隨著分子病理學(xué)發(fā)展和靶向藥物研發(fā),HGSOC的診療取得了很大進步,但復(fù)發(fā)性和多藥耐藥(MDR)仍舊是其治療上的主要障礙［4］。且孕烷X受體(PXR)、多藥耐藥蛋白1(MDR1)、細(xì)胞色素P450 3A5(CYP3A5)和細(xì)胞色素P450 2B6(CYP2B6)可通過不同的方式參與藥物代謝,引起腫瘤的化療耐藥［5］。有研究顯示,PXR基因能調(diào)控CYP3A5、CYP2B6、MDRl基因的表達［6］,引起相應(yīng)基因表達產(chǎn)物改變,從而影響相應(yīng)的藥物代謝,導(dǎo)致MDR的出現(xiàn)［7］。本研究通過免疫組織化學(xué)、實時定量熒光PCR及蛋白印跡等方法,對PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6蛋白及基因進行檢測,比較其在HGSOC和非HGSOC患者及HGSOC化療耐藥和敏感患者間的差異表達,以求為HGSOC患者個體化治療提供更多理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年9月—2021年12月青島市市立醫(yī)院婦科收治的56例HGSOC患者作為試驗組。患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①原發(fā)性HGSOC者;②未合并其他臟器惡性疾病者;③既往無卵巢手術(shù)史者;④行腹腔鏡或者開腹全子宮+雙側(cè)附件+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù),且術(shù)后行鉑類藥物化療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①認(rèn)知功能或精神異常者;②合并有心肝肺等重要臟器疾病者;③臨床資料缺損或丟失者。根據(jù)HGSOC患者對鉑類化療藥的耐藥情況,將初次采用鉑類藥物作為基礎(chǔ)化療藥物并獲得緩解,且停藥超過6個月未復(fù)發(fā)者設(shè)為敏感組;將初次采用鉑類藥物作為基礎(chǔ)化療藥物治療有效,但完成化療6個月內(nèi)復(fù)發(fā)者設(shè)為耐藥組。另選取婦科同期收治的行子宮+雙側(cè)輸卵管切除術(shù)的16例子宮肌瘤患者作為對照組。

1.2 主要試劑和儀器

PXR鼠抗人單克隆抗體購自美國SantaCruz公司,MDR1、CYP3A5和CYP2B6鼠抗人單克隆抗體購自美國Abcam公司,免疫組化二抗PV-6000試劑盒、DAB試劑盒和山羊血清封閉液購自北京中杉金橋生物科技有限公司,GAPDH抗體、兔/鼠二抗購自上海艾比瑪特醫(yī)藥科技有限公司,RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司,熒光定量PCR試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司,PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計,蛋白印跡預(yù)制膠購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司,電泳液、轉(zhuǎn)膜液及裂解液購自上海碧云天生物科技有限公司,TBST購自北京索萊寶生物科技有限公司。儀器包括超微量分光光度計(上海凌光技術(shù)公司)、實時定量PCR儀CFX96 Real-Time PCR Detection System(美國伯樂公司)和電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)等。

1.3 研究方法

1.3.1免疫組織化學(xué)檢測 將試驗組HGSOC患者腫瘤組織及對照組子宮肌瘤患者的正常輸卵管組織置于40 g/L的甲醛溶液中固定,后脫水、包埋、切片、烤片、脫蠟,在檸檬酸鹽緩沖液中加熱進行抗原修復(fù),使用山羊血清封閉;分別滴加PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6一抗,37 ℃下孵育1 h,PBS清洗后滴加二抗,室溫孵育30 min;繼續(xù)用PBS清洗3次,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,封片處理［8］。顯微鏡下觀察,每張切片隨機選取10個具有代表性著色的高倍視野作為最終結(jié)果。使用AxioVision Rel.4.6計算機化圖像分析系統(tǒng)進行拍照。所有切片請病理學(xué)專家評估組織染色的程度,染色區(qū)域評分如下：0分(染色區(qū)域接近0)、1分(染色區(qū)域小于10%)、2分(染色區(qū)域11%～35%)、3分(染色區(qū)域36%～75%)、4分(染色區(qū)域76%～100%);染色強度評分如下：0分(無染色)、1分(弱染色)、3分(中度染色)和4分(強染色)。最終使用染色指數(shù)(SI)評分(SI評分=染色區(qū)域評分×染色強度評分)評價蛋白表達程度,SI評分≥4為陽性,SI評分<4為陰性［9］。統(tǒng)計各組患者中PXR、MDR1、CYP3A5、CYP2B6的陽性例數(shù),并計算各組上述指標(biāo)的陽性表達率。

1.3.2實時熒光定量PCR檢測 將試驗組HGSOC腫瘤組織及對照組正常輸卵管組織分別在液氮中磨碎,按RNA提取試劑盒說明書步驟提取組織RNA,并用分光光度計測量吸光度值計算RNA濃度,根據(jù)各組濃度按照逆轉(zhuǎn)錄和擴增試劑盒說明書分別加入試劑和引物(表1)。在實時定量PCR儀上用兩步法行PCR擴增,首先95 ℃預(yù)變性30 s;然后95 ℃變性 5 s,60 ℃ 退火30 s,共進行40個循環(huán),從而得到各組的溶解曲線。根據(jù)PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6基因擴增的CT值,以GAPDH作為內(nèi)參照,使用2-△△CT法計算出各組PXR、MDR1、CYP3A5、CYP2B6 mRNA的相對表達量。

表1 PCR引物名稱及序列

1.3.3蛋白質(zhì)印跡分析 將試驗組HGSOC腫瘤組織及對照組正常輸卵管組織分別剪碎并充分研磨,加入裂解液和蛋白酶抑制劑及少量液氮勻漿;放置于預(yù)冷離心機中,在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min;離心后EP管中吸取中間層,用BCA法檢測蛋白濃度;加入Loading Buffer,100 ℃下煮沸10 min。根據(jù)測得蛋白濃度進行電泳、轉(zhuǎn)膜,用含體積分?jǐn)?shù)0.05脫脂奶粉的TBST液室溫封閉2 h;以后分別加入PXR (1∶1 000)、MDR1(1∶2 000)、CYP3A5(1∶1 000)、CYP2B6(1∶1 000)和GAPDH(1∶8 000)一抗進行孵育,4 ℃環(huán)境下過夜。TBST清洗后,加入兔/鼠二抗(1∶8 000)室溫孵育1 h,TBST溶液清洗3次后顯影。使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參計算各組PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1 試驗組及對照組患者PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6表達情況比較

本研究試驗組56例患者中耐藥組24例,敏感組32例;對照組患者16例。免疫組化染色結(jié)果顯示,試驗組患者HGSCO組織中PXR、CYP3A5和CYP2B6表達呈陽性,腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色,MDR1表達呈陽性,腫瘤細(xì)胞膜呈棕黃色;對照組患者正常輸卵管組織PXR、CYP3A5和CYP2B6表達呈弱陽性或陰性,細(xì)胞質(zhì)淡黃色或不著色,MDR1表達呈弱陽性或陰性,腫瘤細(xì)胞膜淡黃色或不著色(圖1)。試驗組患者HGSOC組織中PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6的陽性表達率分別為71.4%、75.0%、73.2%和76.8%,對照組患者中上述指標(biāo)的陽性表達率分別為43.8%、37.5%、31.3%和43.8%,試驗組患者HGSCO組織上述指標(biāo)的的陽性率均顯著高于對照組(χ2=12.879～17.174,P<0.05)。

圖1 試驗組與對照組患者相應(yīng)組織PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(HE染色,400倍)

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示,試驗組患者HGSOC組織中PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6 mRNA相對表達量分別為0.79±0.18、0.93±0.06、0.87±0.07和1.01±0.11,對照組患者正常輸卵管組織中上述指標(biāo)mRNA相對表達量分別為0.30±0.05、0.35±0.03、0.31±0.021和0.59±0.05,兩組比較差異有顯著性(t=9.746～17.640,P<0.05)。

蛋白印跡實驗結(jié)果顯示,試驗組患者HGSOC組織中PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6蛋白的相對表達量分別為1.15±0.16、0.96±0.03、1.13±0.14和1.18±0.07,對照組患者正常輸卵管組織中上述指標(biāo)的相對表達量分別為0.56±0.00、0.68±0.06、0.54±0.05和0.58±0.08,兩組比較差異有顯著性(t=13.312～60.448,P<0.05)。見圖2。

圖2 試驗組與對照組患者PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6蛋白的表達量

2.2 敏感組及耐藥組患者PXR、MDR1、CYP3A5Y和CYP2B6表達情況比較

耐藥組患者的HGSOC組織中PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6的陽性表達率分別為87.50%、91.70%、87.50%和95.80%,敏感組患者HGSOC組織中上述4指標(biāo)的陽性表達率則分別為59.40%、62.50%、62.50%和62.50%,兩組比較差異有顯著性(χ2=4.371～8.549,P<0.05)。

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示,耐藥組患者HGSOC組織中PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6的mRNA相對表達量分別為0.83±0.10、0.93±0.08、0.87±0.08和1.01±0.09,敏感組患者HGSOC組織中上述指標(biāo)mRNA的相對表達量分別為0.57±0.07、0.50±0.04、0.55±0.02和0.49±0.08,兩組比較差異具有顯著性(t=6.859～19.000,P<0.05)。

蛋白印跡實驗結(jié)果顯示,耐藥組患者HGSOC組織中PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6蛋白相對表達量分別為1.01±0.02、1.13±0.10、0.90±0.07和1.23±0.04,敏感組患者HGSOC組織中上述指標(biāo)的蛋白相對表達量分別為0.73±0.04、0.47±0.06、0.44±0.26和0.60±0.14,兩組比較差異有顯著性(t=8.693～27.670,P<0.05)。見圖3。

圖3 耐藥組與敏感組患者PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6蛋白的表達量

2.3 試驗組患者HGSOC組織中PXR與MDR1、CYP3A5、CYP2B6的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析顯示,試驗組患者HGSOC組織中PXR與CYP3A5、CYP2B6的表達呈正相關(guān)(r=0.332、0.308,P<0.05),而與MDR1無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

3 討 論

約80%卵巢癌患者在行全子宮+雙側(cè)附件+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)后,會接受卡鉑或順鉑和紫杉醇輔助化療,其中70%患者會復(fù)發(fā),進而對標(biāo)準(zhǔn)化療方案中的鉑類藥物產(chǎn)生耐藥,尤其是HGSOC患者,在治療中面臨著MDR的挑戰(zhàn),其預(yù)后往往較差［10-11］。有研究指出MDR潛在的機制有：①通過外排泵,如ABCB1編碼的MDR1,增加藥物的泵出;②通過藥物代謝轉(zhuǎn)運體(如MDR1表達的P-糖蛋白)使藥物攝取減少;③激活細(xì)胞色素P450酶系(CYPs)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等藥物代謝酶［12-13］,從而分解藥物并促進其排出。本研究通過免疫組化、實時定量熒光PCR以及蛋白印跡方法,證明了PXR、MDR1、CYP3A5以及CYP2B6在試驗組患者HGSOC組織中表達升高;其中耐藥組中患者PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6的mRNA及蛋白相對表達量均顯著高于敏感組,提示了HGSOC患者腫瘤組織中PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6的高表達可能與耐藥相關(guān)。因此可以通過檢測上述因子,來預(yù)測HGSOC患者對化療的敏感性,或者通過靶向抑制這些因子的表達來提高HGSOC患者對化療藥物的敏感性,以獲得更有效的治療效果。

PXR是核受體超家族的典型成員,在細(xì)胞內(nèi)的主要功能是通過配體依賴的方式與調(diào)控基因序列結(jié)合,在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期等過程中發(fā)揮著重要作用［14］。PXR與宮頸癌、結(jié)腸癌及肺癌等多種惡性腫瘤相關(guān)［5］。PXR在解毒過程中也發(fā)揮著重要的作用,內(nèi)源性化合物及化療藥物等外源性化合物在體內(nèi)都可以通過結(jié)合配體激活PXR,上調(diào)藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體(例如CYPs和多藥耐藥蛋白等)的表達,從而加速自身在體內(nèi)的代謝和清除［15］,上述過程使化療藥物的效果大打折扣。本研究中,試驗組患者中PXR陽性表達率和mRNA及蛋白相對表達量均明顯高于對照組,說明PXR可能參與HGSOC的發(fā)生發(fā)展過程,這與VETTER等［16］的研究結(jié)果一致。MDR1是一種膜結(jié)合的ABC轉(zhuǎn)運蛋白,它編碼的P-糖蛋白參與多種抗癌藥物(包括阿霉素、紫杉烷和鉑類)的MDR。人體內(nèi)MDR1可以廣泛結(jié)合多種底物化合物,并利用ATP水解作用將化療藥物排出癌細(xì)胞［17］,降低化療藥物的療效。因此其存在是卵巢癌化療失敗的重要原因之一［18］。本研究中,試驗組患者MDR1陽性表達率和mRNA及蛋白相對表達量均明顯高于對照組。另外既往研究顯示MDR1與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展及臨床預(yù)后有關(guān)［19］。喻朝霞等［20］的研究也發(fā)現(xiàn),MDR1的高表達參與了上皮性卵巢癌的發(fā)生及由良性到惡性的進展過程。這也與本研究的結(jié)論一致,提示MDR1可以作為HGSOC發(fā)生發(fā)展,尤其是從正常組織或良性病變進展為惡性病變的輔助診斷標(biāo)志物之一。

CYPs是藥物代謝的主要催化劑之一,其功能受基因多態(tài)性的影響較大,從而導(dǎo)致了藥物療效和(或)個體間差異顯著［21］。CYP3A5基因位點的遺傳變異影響了包括免疫抑制劑他克莫司、環(huán)孢素等在內(nèi)的多種臨床藥物代謝［22］。SEELIG等［18］發(fā)現(xiàn)CYP3A5蛋白在多種惡性腫瘤中呈高表達,重要的是,它在外分泌樣亞型腫瘤中會降低腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性,使其對酪氨酸激酶抑制劑和紫杉醇產(chǎn)生耐藥性,這使得CYP3A5可能成為檢驗化學(xué)藥物療效和腫瘤早期診斷的預(yù)測因子。CYP2B6是人類唯一屬于CYP2B亞家族的酶,其主要在成人肝臟中表達［23］,可參與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒、抗瘧疾、抗癌以及抗抑郁藥物的代謝過程,但是受自身基因多態(tài)性的影響［24］,其催化活性和表達在個體之間差異較大。本研究中,試驗組患者CYP3A5、CYP2B6的陽性表達率和mRNA及蛋白相對表達量均明顯高于對照組,提示CYP3A5、CYP2B6的高表達可能參與了HGSOC的增殖侵襲過程。

為進一步探究HGSOC患者腫瘤組織中PXR、MDR1、CYP3A5以及CYP2B6間關(guān)系,本研究進行了Spearman相關(guān)分析,結(jié)果顯示PXR與CYP3A5和CYP2B6的表達正相關(guān),也與已有報道一致［25］;CREAMER等［15］的研究表明PXR可調(diào)控MDR1的表達并存在協(xié)同作用,而本研究中PXR與MDR1無相關(guān)性,故后續(xù)可通過擴大樣本量、細(xì)化實驗如體外卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)、干擾PXR表達及觀察MDR1表達有無變化等進一步研究兩者間的關(guān)系。

綜上所述,PXR、MDR1、CYP3A5、CYP2B6在HGSOC患者的腫瘤組織中呈高表達,其可能參與HGSOC的發(fā)生發(fā)展過程。PXR、MDR1、CYP3A5和CYP2B6的表達水平可用于判斷HGSOC對化療藥物的敏感性,有助于為術(shù)后化療提供指導(dǎo)意見。

倫理批準(zhǔn)和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過青島市市立醫(yī)院科學(xué)倫理委員會的審核批準(zhǔn)(文件號2022臨審字第093號)。所有試驗過程均遵照《青島市市立醫(yī)院中心實驗室守則》的條例進行。受試對象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

作者聲明：張萍、馬嵐和陳樺參與了研究設(shè)計;張萍、陳樺參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。