lncRNA SNHG1對乳腺癌細胞遷移、侵襲和上皮-間質轉化的影響及其機制

鄧林 吳清蘭 宋軍瑩 高笑 肖歡歡 張麗 曹奕 侯琳

(青島大學,山東 青島 266071 1 基礎醫學院生物化學與分子生物學系;2 藥學院;3 生物醫學實驗中心)

乳腺癌是世界上最常見的惡性腫瘤,同時也是導致女性死亡的主要原因［1］。手術、化療和放療均為目前乳腺癌的主要治療方式,但乳腺癌的復發率以及轉移率依然很高［2］。因此,尋找乳腺癌發病的潛在機制和有效的治療靶點,是改善患者預后的關鍵所在。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度超過200個核苷酸并且不能編碼蛋白質的一種RNA［3］,其可通過多種途徑參與細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學過程的調控,與腫瘤的發生密切相關［4-5］。研究發現lncRNASNHG1在結直腸癌組織內表達上調,與腫瘤轉移和分期相關,下調SNHG1的表達在體外和體內均可以顯著抑制結直腸癌細胞的生長［6］;SNHG1在胃癌中發揮癌基因功能,可以影響胃癌細胞的增殖和上皮-間質轉化(EMT)過程［7］。微RNAs(miRNAs)是一種長度大約為22個核苷酸的非編碼RNA,lncRNA可調控miRNA表達,與腫瘤發生相關［8-9］。研究顯示,miR-641可通過抑制乳腺癌細胞生長和侵襲來調節乳腺癌的進程［10］。目前,乳腺癌中關于SNHG1功能和機制的研究依然很少。本研究通過RNA干擾技術及雙熒光素酶實驗,探討了SNHG1靶向調控miR-641的分子機制及對乳腺癌細胞遷移、侵襲和EMT的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

SNHG1小干擾RNA(si-SNHG1)、miR-NC、miR-641 mimics、si-NC、anti-miR-641、anti-miR-NC(上海吉瑪制藥技術有限公司),Trizol試劑、RNA逆轉錄試劑盒以及實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒(南京諾維贊生物有限公司),兔抗人上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)、神經型鈣黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)多克隆抗體(武漢三鷹生物技術有限公司),LipofectamineTM2000轉染試劑(美國Invitrogen公司),雙熒光素酶活性檢測試劑盒(上海全式金生物技術有限公司)。

1.2 細胞培養

細胞系MCF-10A、MCF-7、BT-549、MDA-MB-231和MDA-MB-468均購自中國科學院細胞庫。將MCF-10A、MCF-7、BT-549、MDA-MB-231以及MDA-MB-468細胞分別置于含體積分數0.10的胎牛血清的DMEM/F12和DMEM中,在37 ℃、含體積分數0.05的CO2恒溫培養箱中培養至對數生長期用于后續實驗。

1.3 RT-qPCR檢測lncRNA SNHG1和miR-641表達

收集青島大學附屬腫瘤醫院20例病理確診為乳腺癌患者的癌組織和癌旁正常組織,置于標本儲存液中,-80 ℃保存備用。使用Trizol試劑提取乳腺癌組織、癌旁正常組織及細胞(MCF-10A、MCF-7、BT-549、MDA-MB-231和MDA-MB-468)中的總RNA。然后用微量核酸定量儀進行RNA濃度檢測,并將RNA反轉為cDNA,根據試劑盒說明進行RT-qPCR。對于miRNA,通過莖環法合成cDNA,以U6作為miRNA內參照。SNHG1的內參照為GAPDH。利用2-△△CT方法計算目的基因的相對豐度。繼而選擇SNHG1表達較正常乳腺上皮細胞MCF-10A細胞基因差異最顯著(P值最小)的乳腺癌細胞BT-549進行后續實驗。引物名稱及其序列詳見表1。

表1 引物名稱及其序列

1.4 BT-549細胞轉染和分組

處于對數生長期BT-549細胞接種于6孔板中,待細胞匯合度約達60%時,分為A～D組,分別用LipofectamineTM2000轉染試劑將si-NC(A組)、si-SNHG1(B組)、si-SNHG1與anti-miR-641-NC(C組)、si-SNHG1與anti-miR-641(D組)轉染BT-549細胞,6 h后換液。繼續培養36 h,RT-qPCR方法檢測A、B組細胞中SNHG1及miR-641表達水平,收集各組細胞用于后續實驗。

1.5 Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲能力

取A～D組培養36 h的BT-549細胞,以無血清培養基重懸細胞后,于Transwell小室上室加入100 μL(約1×104個細胞)細胞懸液,下室加入600 μL含體積分數0.20的血清培養基。細胞培養24 h后,停止實驗。去除小室中培養基,將遷移過膜的細胞用40 g/L的多聚甲醛固定20 min,PBS沖洗3次,再用1 g/L的結晶紫染色15 min。隨后用棉簽輕柔擦除未遷移過膜、殘留于上室的細胞,PBS沖洗3次,晾干,顯微鏡下觀察并計算遷移細胞數量。無血清DMEM培養基與基質膠按8∶1比例混合,隨后將稀釋的基質膠均勻加入到小室上室內,晾干。取A～D組培養36 h的BT-549細胞懸液加入到小室上室內,后續操作同細胞遷移步驟,最后顯微鏡下觀察并計算侵襲細胞數量。

1.6 Western blot方法檢測細胞中的E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達量

取A～D組培養36 h的BT-549細胞,RIPA將細胞充分裂解后,收集裂解液,4 ℃下12 500 r/min離心20 min。將上清液轉移至新的離心管中,加入1/4體積的5×loading buffer,充分振蕩混勻,煮沸10 min,收集蛋白樣本。通過SDS-PAGE電泳分離蛋白,并轉移到PVDF膜上。用體積分數0.05的脫脂牛奶在室溫下封閉膜2 h后,一抗4 ℃下孵育過夜,TBST洗膜3次,每次10 min。再用辣根過氧化物酶標記的二抗在室溫下與膜孵育1 h,洗膜,暗室中曝光顯影。利用Image J軟件分析蛋白灰度值,并計算目的蛋白的相對表達量。

1.7 雙熒光素酶報告基因實驗檢測SNHG1以及miR-641的靶向關系

通過Starbase v2.0數據庫檢索發現,SNHG1與miR-641存在互補序列。然后合成含miR-641結合位點的SNHG1野生型(SNHG1-WT)序列以及相應突變型(SNHG1-MUT)序列,并被克隆到pSI-check2質粒中。處于對數生長期BT-549細胞在24孔板中培養,當細胞匯合度約達60%時,將SNHG1-WT與miR-641 mimics(E組)、SNHG1-WT與miR-NC(F組)以及SNHG1-MUT與miR-641 mimics(G組)、SNHG1-MUT與miR-NC(H組)通過LipofectamineTM2000共轉染BT-549細胞,培養48 h后,棄培養基,PBS沖洗2次,加入裂解液室溫裂解10 min,4 ℃下離心,取上清液檢測熒光素酶活性,相對熒光素酶活性以螢火蟲與海腎熒光素酶活性比值表示。

1.8 統計學分析

2 結 果

2.1 乳腺癌組織中lncRNA SNHG1、miR-641的表達情況

RT-qPCR檢測結果顯示,SNHG1和miR-641在癌旁正常組織中相對表達量分別為1.01±0.01、0.98±0.125,而在乳腺癌組織中的相對表達量分別為2.15±1.08、0.49±0.12。與癌旁正常組織相比,乳腺癌組織中的SNHG1表達明顯升高(t=4.81,P<0.05),而miR-641表達顯著降低(t=7.96,P<0.05)。

2.2 乳腺癌細胞中lncRNA SNHG1、miR-641的表達情況

MCF-10A及4種乳腺癌細胞(MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7和BT-549)中SNHG1以及miR-641表達量比較差異均有顯著性(F=36.23、79.32,P<0.05),其中與MCF-10A相比,4種乳腺癌細胞中SNHG1的表達均上調(t=8.11～10.79,P<0.05),miR-641表達下調(t=9.16～11.17,P<0.05);SNHG1以及miR-641在4種乳腺癌細胞之間相比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。選擇SNHG1表達較MCF-10A細胞基因差異最具有顯著性(P值最小)的乳腺癌細胞BT-549進行后續實驗。

表2 SNHG1和miR-641在正常乳腺上皮細胞及乳腺癌細胞中的表達

2.3 下調lncRNA SNHG1的表達對于細胞中SNHG1、miR-641的影響

A組與B組中SNHG1相對表達水平分別為1.00±0.06和0.34±0.02,B組中SNHG1水平顯著降低(t=22.16,P<0.05)。A組與B組中miR-641相對表達水平分別為1.00±0.06、2.29±0.10,B組中miR-641的表達水平顯著升高(t=19.45,P<0.05)。

2.4 下調lncRNA SNHG1表達對BT-549細胞遷移、侵襲和EMT的影響

Transwell實驗結果顯示,與A組相比較,B組BT-549細胞遷移、侵襲過膜細胞數均明顯減少(t=9.08、5.80,P<0.05)。Western blot方法檢測結果顯示,與A組相比較,B組BT-549細胞EMT相關蛋白N-cadherin以及Vimentin的表達均明顯下降(t=3.95、5.27,P<0.05),而E-cadherin蛋白表達明顯升高(t=7.43,P<0.05)。見表3。

表3 各組細胞遷移、侵襲細胞數及EMT相關蛋白表達量比較

2.5 下調miR-641可逆轉沉默SNHG1對BT-549細胞遷移、侵襲與EMT的影響

與C組相比,D組BT-549細胞遷移、侵襲過膜的細胞數量顯著增加(t=9.19、7.76,P<0.05),N-cadherin和Vimentin蛋白表達明顯升高(t=9.86、13.83,P<0.05),而E-cadherin蛋白表達顯著降低(t=3.59,P<0.05)。見表3。

2.6 雙熒光素酶活性分析

實驗結果表明,E組與F組的熒光素酶活性分別為0.47±0.06、1.00±0.08,E組熒光素酶活性顯著降低(t=8.37,P<0.05);G組與H組的熒光素酶活性分別為0.97±0.15、1.01±0.08,兩組熒光素酶活性比較無明顯差異(P>0.05)。

3 討 論

乳腺癌作為一種高異質性疾病,復發率和轉移率很高,整體治療效果不理想,所以尋找新的治療靶點以降低乳腺癌患者的病死率,仍是公眾關注的重點［11-12］。lncRNA的失調與多種惡性腫瘤(包括乳腺癌)的發生密切相關［13］。因此,lncRNA在腫瘤中的功能和調控機制已經成為當前的研究熱點,以發現腫瘤診斷和治療的新靶點。

SNHG1由8個核仁內小RNA組成,位于人類11號染色體上,具有11個外顯子。SNHG1與腫瘤的發生密切相關,在多種腫瘤組織中高表達,促進腫瘤的發生［14-15］。大量研究顯示,lncRNA在調控乳腺癌細胞遷移和侵襲等生物學過程中起著重要的作用。例如lncRNAAC073352.1可以結合Y-框結合蛋白1(YBX1)促進乳腺癌遷移、侵襲和血管生成［16］;SNHG1在肝癌細胞中高表達,并通過激活AKT通路介導索拉非尼耐藥,并與患者預后不良有關,對肝癌具有潛在診斷價值［17］。

本研究首先收集了20例乳腺癌組織和其癌旁的正常組織,檢測發現SNHG1在乳腺癌組織中明顯上調。隨后,利用RT-qPCR方法進行進一步驗證SNHG1在乳腺癌細胞水平的表達情況,相比較于人正常乳腺上皮細胞MCF-10A,4種乳腺癌細胞(MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7和BT-549)中SNHG1表達均上調。為了探索SNHG1在乳腺癌中的作用,選擇SNHG1表達量上調最為顯著且具有遷移能力的BT-549細胞作為研究對象。通過BT-549細胞轉染SNHG1的小干擾RNA下調其表達量,隨后Transwell實驗檢測SNHG1表達對BT-549細胞遷移和侵襲能力的影響。結果顯示,下調SNHG1表達后,細胞遷移、侵襲過小室膜的數量顯著減少,提示SNHG1可促進乳腺癌細胞的遷移與侵襲。為了探明SNHG1促進乳腺癌發生的具體分子機制,通過對Starbase v2.0數據庫檢索發現SNHG1與miR-641存在互補結合序列,同時RT-qPCR結果顯示在乳腺癌組織和乳腺癌細胞中SNHG1呈現高表達,miR-641呈現低表達,提示SNHG1可能通過靶向miR-641促進乳腺癌的進展。RT-qPCR檢測結果也顯示,在BT-549細胞中下調SNHG1以后miR-641的表達升高。隨后,在BT-549細胞中共轉染SNHG1的小干擾RNA以及anti-miR-641,發現敲低miR-641后可以逆轉下調SNHG1對BT-549細胞侵襲和遷移的抑制作用,證實了SNHG1可通過miR-641促進乳腺癌細胞的遷移和侵襲。

EMT是胚胎發育中極其重要的一個過程,能夠讓細胞在胚胎發育過程中在上皮和間質狀態之間轉換。EMT也是促進腫瘤細胞轉移的主要原因之一［18-19］。在EMT發生過程當中,上皮標志物例如E-cadherin表達降低,而間質標志物如N-cadherin和Vimentin表達升高［20］。發現SNHG1在前列腺癌中通過與hnRNPL競爭性結合阻止E-cadherin翻譯,進而促進EMT過程［21］。本研究顯示,下調SNHG1可以提高BT-549細胞中E-cadherin蛋白表達水平,降低N-cadherin以及Vimentin蛋白表達,抑制了EMT過程,而敲低miR-641可以逆轉由下調SNHG1表達對BT-549細胞EMT過程的抑制作用。多項研究表明,lncRNA可以作為miRNA的“海綿”,從而調節腫瘤的生物學功能［22］,lncRNAMCM3AP-AS1在肝癌中靶向負調控miR-194-5p,促進FOXA1的表達,進而調節肝癌細胞增殖、遷移和侵襲［23］。研究發現,miR-641在神經膠質瘤中低表達,lncRNACOX10-AS1作為miR-641的“海綿”調節神經膠質瘤增殖、遷移和侵襲過程［24］。還有研究表明miR-641可以調控乳腺癌進程,下調miR-641可以靶向SRCAP抑制乳腺癌細胞生長、侵襲和EMT過程,提示miR-641可能作為治療乳腺癌的潛在靶點［10］。本研究利用雙熒光素酶實驗進一步驗證SNHG1能否靶向調控miR-641,結果顯示miR-641可以顯著抑制野生型SNHG1的熒光素酶活性,對突變型SNHG1的熒光素酶活性無影響,提示SNHG1可以靶向調控miR-641。

綜上所述,SNHG1在乳腺癌組織和細胞中高表達,SNHG1可通過靶向調控miR-641促進乳腺癌細胞侵襲、遷移以及EMT過程。SNHG1/miR-641軸的研究為乳腺癌的靶向治療提供了新的可能。然而,本研究尚未探究miR-641下游的分子機制,且未進行體內實驗驗證SNHG1/miR-641軸對乳腺癌的影響,后續將對此進行深入的研究。

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過青島大學醫學部倫理委員會的審核批準(文件號QDU-HEC-2022259)。所有試驗過程均遵照《人體醫學研究的倫理準則》的條例進行。受試對象或其親屬已經簽署知情同意書。

作者聲明：鄧林、吳清蘭、宋軍瑩、高笑、肖歡歡、張麗、曹奕、侯琳參與了研究設計;鄧林、侯琳參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。