基于基因數據庫分析MPTP誘導的帕金森病小鼠黑質中差異表達基因及其意義

李貝寧 姚征洋 焦倩 陳曦 姜宏 杜希恂

(青島大學國家重點(培育)學科生理學,山東 青島 266071)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種常見的神經退行性疾病,其病理特征是黑質多巴胺能神經元的選擇性喪失及殘存的多巴胺能神經元中出現以聚集α-突觸核蛋白(α-syn)為主要成分的路易小體。PD患者的臨床癥狀主要表現為運動遲緩、靜止性震顫和肌僵直［1-3］。其中5%～10%病例是單基因突變導致,另外環境因素也是導致PD發病的一個很重要的因素［4］,但是到目前為止,PD發病機制仍不明確。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)可通過誘導細胞內氧化應激、線粒體凋亡、炎癥、興奮性毒性和包涵體形成等一系列細胞內反應,造成小鼠黑質致密部多巴胺能神經元的缺失及紋狀體多巴胺含量降低,進而出現PD樣運動表型。MPTP誘導的PD模型是研究PD發病機制和藥物干預的重要模型工具［5-7］。

近年來,通過生物信息學手段對生物大數據的分析在生物醫學的多個領域均有應用。本研究利用R語言(Limma包)對公共基因芯片數據庫(GEO)當中正常組和PD模型組小鼠黑質組織的基因表達譜芯片進行差異表達基因(DEGs)篩選［8］。并利用Metascape在線工具對DEGs進行GO功能富集分析以及KEGG通路分析,結合實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測結果,探討PD模型小鼠黑質組織中相關基因組以及信號通路的變化,篩選出靶向DEGs,為臨床預防、診斷以及治療等方面研究提供新的思路和研究方向。

1 材料與方法

1.1 基因芯片來源

正常組和PD模型組小鼠黑質組織中基因表達譜芯片數據來源于NCBI的GEO數據庫(http：/www.ncbi.nlm.gov/geo/),登錄號為GSE4788。該數據庫當中符合要求的小鼠黑質組織樣本共8例,其中編號GSM108079、GSM108080、GSM108081、GSM108045為正常組小鼠的黑質組織樣本,編號GSM108088、GSM108089、GSM108090、GSM108091為PD模型組小鼠黑質組織樣本。

1.2 DEGs篩選

通過R語言(Limma包)篩選基因芯片中正常組和PD模型組小鼠黑質組織的DEGs,篩選條件為P<0.05,變化倍數>0.26。

1.3 火山圖和熱圖分析兩組小鼠黑質組織中的DEGs

將上面獲得的每個DEGs表達水平的具體數值,按照R語言volcano及pheatmap包的要求做出對應的矩陣列表,采用火山圖和熱圖對DEGs進行可視化分析。

1.4 GO功能富集分析和KEGG通路分析

采用Metascape在線工具將篩選出的上調和下調的DEGs進行分析,并進行GO功能富集分析和KEGG通路分析,以P<0.05為顯著富集,P值越小表示富集越顯著,通過R語言(ggplot2包)將分析結果可視化,獲得P值較小的生物功能及具有顯著差異的通路,同時選取參與這些功能和通路的基因,用于后續小鼠的驗證。

1.5 RT-qPCR檢測關鍵功能性基因的表達

8～10周齡雄性C57BL/6J小鼠購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司,分為正常組和試驗組,每組4只。試驗組的小鼠腹腔注射MPTP(20 mg/kg),正常組小鼠腹腔注射等劑量生理鹽水,均每天1次,連續5 d。第5天時吸入異氟烷深度麻醉小鼠,眼部放血后斷頭取出小鼠腦組織,分離黑質組織后置于脫酶EP管中。每管中加入500 μL TRIzol,研磨儀研磨后,提取兩組小鼠黑質組織的總RNA,并進行濃度與純度的檢測。

根據Vazyme逆轉錄試劑盒說明,以所提取的RNA為模板合成互補cDNA。采用SYBR-Green染料法定量檢測目的基因Bdnf、Fbxw7、Sod1表達水平,根據熒光定量PCR說明書配制反應體系,每個樣品設置3個復孔,采取兩步法經過40個循環完成擴增,并采用2—ΔΔCT法計算各基因相對表達量。引物及其序列見表1。

表1 引物名稱及其序列

2 結 果

2.1 正常組和PD模型組小鼠黑質組織的DEGs

R語言(Limma包)分析結果顯示,正常組和PD模型組小鼠黑質組織中的DEGs共347個,其中有174個DEGs表達上調,173個DEGs表達下調(圖1A、B)。圖1A的橫坐標為基因表達倍數的對數值,其中紅色為上調的基因,藍色為下調的基因,黑色為無顯著差異基因;圖1B中藍色為低表達基因,紅色為高表達基因。

A：DEGs的火山圖分析,B：DEGs的熱圖分析

2.2 DEGs的GO功能富集分析以及KEGG通路分析

對正常組和PD模型組小鼠黑質組織中DEGs進行GO功能富集分析,結果顯示,上調的DEGs顯著參與了細胞大分子生物合成、分解代謝、神經元發育、鐵離子穩態、蛋白水解及跨質膜輸出等多個生物學功能,下調的DEGs顯著參與了突觸囊泡釋放、跨突觸復合體傳遞以及神經元凋亡等功能(圖2A);KEGG通路分析顯示,上調的DEGs參與朊病毒傳播、Hippo信號等通路,下調的DEGs參與多巴胺能神經元突觸形成、細胞骨架中肌動蛋白的調節等多個生物學功能(圖2B)。R語言(ggplot2包)可視化分析顯示,P值較小的生物功能及具有顯著差異的通路為神經元凋亡、朊病毒傳播,同時選取參與這些功能和通路的基因Bdnf、Fbxw7及sod1,用于后續小鼠的驗證。

A：GO功能富集分析,B：KEGG通路分析

2.3 神經元凋亡相關基因Bdnf、Fbxw7及sod1的mRNA表達

正常組和PD模型組小鼠黑質組織中BdnfmRNA的相對表達量分別為1.40±1.13、0.32±0.36,Fbxw7 mRNA的相對表達量分別為1.16±0.66、0.37±0.37,sod1 mRNA的相對表達量分別為1.01±0.16、1.14±0.22。與正常組相比,PD模型組小鼠黑質組織中Bdnf、Fbxw7的表達量均顯著降低(t=2.25、2.39,P<0.05),sod1的表達無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

PD是一種與年齡相關的神經退行性疾病,與眾多基因和信號轉導分子的表達異常有關。目前,幾乎所有的治療方式只能對癥治療,并不能從根本上逆轉或延緩PD的發生或發展。近年來,關于PD的免疫和基因治療研究也取得了一定的成效。然而,因為PD發病機制不明,這些治療也只能針對少數普遍活化的通路或分子靶標,且臨床療效也不理想。因此,深入了解病程進展過程中的分子事件將成為人們尋求PD有效干預靶點的必要途徑［9-11］。

基因芯片具有特異性好、通量高、時效快的特點,可直接檢測mRNA的種類及豐度,進行整個基因組范圍的基因表達分析,除具有高效、快速、平行化檢測大規模基因表達的優勢之外,還可以發現許多新的、潛在的、也許非常重要的PD相關基因,是研究基因表達的有力工具。本研究通過使用R語言(Limma包)和Metascape在線工具,對正常組和PD模型組小鼠黑質組織的基因芯片表達譜數據集進行了生物學挖掘以及生物信息學分析,以利于更進一步的PD分子生物學研究。

本研究首先從GEO數據庫中下載8例來源于小鼠樣本的基因表達譜,差異表達分析顯示,PD模型小鼠黑質組織中上調的DEGs有174個,下調的DEGs有173個。為進一步了解這些DEGs在PD發病中的作用,又一步利用Metascape在線工具進行了GO功能富集分析和KEGG通路分析。GO功能富集分析結果顯示,MPTP處理后,小鼠黑質組織表達上調的基因顯著參與了細胞大分子生物合成、分解代謝、神經元發育、鐵離子穩態、蛋白水解、跨質膜輸出等生物學過程;而下調的基因顯著參與了突觸囊泡釋放、跨突觸復合體傳遞、神經元凋亡等過程。相關基因的上調預示著相關蛋白穩態失調及蛋白質組成完整性降低,可能會導致錯誤折疊和聚集的蛋白質進一步積累,增加了PD等神經退行性疾病的發病風險［12］。此外,PD中多巴胺能神經元的鐵超載可能也與這些基因表達水平的改變有一定相關性［13-16］。鐵超載通過生成大量羥自由基和引起細胞內α-syn的聚集,最終導致與運動和認知障礙相關的腦區神經元損傷。Netrin1是一種分泌型層粘連蛋白相關蛋白,對神經系統的發育至關重要。相關研究表明,Netrin1能夠通過UNC5B受體調控Hippo通路在黑質多巴胺能神經元缺失中發揮關鍵作用［17-19］。KEGG通路分析表明上調的基因參與Hippo信號,因此這些基因的改變與PD的發生具有重要關系。在分析下調基因參與的生物學過程中,本研究發現最為顯著的是參與細胞骨架組織的相關分子產生的調節,因此考慮到肌動蛋白在突觸功能中的重要作用,提示在神經退行性疾病中存在這種細胞骨架成分的失調［20-22］。

通過GO功能富集分析和KEGG通路分析,P值較小的生物功能及具有顯著差異的通路為神經元凋亡、朊病毒傳播,選取參與這些功能和通路的關鍵功能性基因Bdnf、Fbxw7以及sod1又進行了RT-qPCR檢測,結果顯示,與正常組相比,PD模型組小鼠黑質組織中Bdnf、Fbxw7的表達量均顯著降低,而sod1的表達量無顯著差異。研究表明Bdnf基因編碼的蛋白是神經生長因子家族的一員,在突觸發育和可塑性過程中起著重要作用,其損傷與PD的病理癥狀相關,提示該神經肽減少促進了神經元的凋亡［23-24］;另外由于Fbxw7是一個重要的抑癌基因,且在蛋白酶體降解中發揮作用,從而影響細胞周期進展、細胞分化和存活,提示其缺失會影響細胞凋亡［25-26］。而PD中功能失調的Sod1蛋白的累積及神經元損傷可能與Sod1基因變化無關,提示野生型蛋白異常翻譯后的修飾可能是由神經元內較強的氧化應激和退化腦區的金屬離子穩態失調共同作用導致的［27］。另外,Sod1不同位點等位基因的攜帶者患PD的風險顯著不同［28］。

本研究利用生物信息學技術及方法探討了PD模型小鼠的DEGs,分析可能與PD疾病發生相關的DEGs及其相關的生物學過程,篩選得到的調控神經元凋亡的關鍵功能性基因Bdnf和Fbxw7在PD模型中有顯著改變,為進一步闡明其在PD病理進展中的作用奠定了基礎。該研究表明PD的發生、發展與多基因異常引起功能改變及多條信號通路異常有關,為臨床PD的診斷及治療提供了新的思路和理論依據。

倫理批準和動物權利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學醫學倫理委員會的審核批準(文件號QDU-AEC-2023350)。所有實驗過程均遵照《青島大學實驗動物操作標準》的條例進行。

作者聲明：李貝寧、杜希恂、姜宏參與了實驗設計;李貝寧、姚征洋、焦倩、陳曦參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。