基于P72、MGF和CD2v基因的非洲豬瘟三重熒光定量PCR檢測方法的建立

張紅云 陳秋英 嚴斯剛 杜泓明 陸志翔 鄭敏 羅廷榮*

（1.廣西大學生命科學與技術學院，廣西 南寧 530004；2.廣西悅牧生物科技有限公司，廣西 南寧 530006；3.廣西璞締恩葳生物技術有限公司，廣西 南寧 530006；4. 柳州市動物疫病預防控制中心，廣西 柳州 545026；5.廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530004；6.廣西壯族自治區動物疫病預防控制中心，廣西 南寧 530004）

2018年8月在我國遼寧省首次報道非洲豬瘟（African swine fever，ASF）疫情，隨后疫情從東北地區迅速蔓延至全國各地，對我國養豬業造成了不可估量的經濟損失［1］。非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是非洲豬瘟病毒科（Asfarviridae）的一種病毒，僅感染豬科動物［2］。

ASF剛傳入中國呈現出感染性強、毒力強的特點，表現為高熱、皮膚充血、多器官出血及流產、快速傳染和死亡等急性癥狀，給養豬業造成重大損失。隨著ASFV在中國的定殖，逐步出現基因缺失株、自然變異株、自然弱毒株等基因變異毒株，與傳統的野毒株相比，生豬感染基因變異毒株后，表現為排毒滴度低、間隙性排毒、潛伏期長、難以早期發現和精確監測。基因變異毒株的基因組序列、致病力等發生明顯變化。

ASFV基因變異毒株侵染初期沒有明顯的臨床癥狀，采用抗體檢測無法區分所感染病毒株的類型，采用保守的P72蛋白序列研制的熒光定量PCR方法進行檢測，雖然可以盡早發現被ASFV感染的豬只，但是無法鑒別野毒株與基因變異毒株，因此建立能夠鑒別野毒株和基因變異毒株的多重熒光定量PCR方法，對構建豬場生物安全屏障，開展ASFV的野毒株和基因變異毒株的鑒別診斷意義重大，有利于養殖場采取相應措施進行防控。

1 材料與方法

1.1 材料

豬圓環病毒2型（PCV2）、豬偽狂犬病病毒（PRV）和豬細小病毒（PPV） 的DNA陽性對照由廣西璞締恩葳生物技術有限公司實驗室提供。本實驗的陽性對照及構建質粒的模板是在廣西動物疫病預防控制中心組織的ASFV比對試驗中驗證為ASFV陽性的樣本。經鑒定，在陽性樣本中，有野生型ASFV及MGF-CD2v基因雙缺失的ASFV兩種樣本。2×Taq PCR Mastermix（KT201-12）、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP209-02）、pLB 零背景快連接試劑盒（VT205-01）、DH5α感受態細胞（CB101-01）和質粒小提試劑盒（DP103-02）購自天根生化科技（北京）有限公司。DNA marker LD DS2000（LM1101）購自廣州東盛生物科技有限公司。Animal Detection U+ Probe Master Mix （QV110-01）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 引物設計

以專利《基因缺失的減毒非洲豬瘟病毒及其作為疫苗的應用》為參考［3］，對非洲豬瘟病毒中國流行株Pig/CN/HLJ/2018（GenBank登錄號：MK333180.1）的缺失情況進行分析。根據ASFV基因缺失毒株（HLJ/18-7GD株）的兩個基因CD2v和MGF的缺失位置設計引物（見表1），用于鑒定野生毒株和基因缺失毒株。

表1 ASFV野生株與基因缺失毒株鑒別引物列表

1.3 重組質粒標準品的構建與鑒定

通過PCR方法從ASFV陽性DNA模板擴增相應基因片段。反應體系如下：2×Taq PCR Mastermix 25 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL，核酸模板5 μL，加ddH2O補充至50 μL。

將PCR產物純化回收后分別連接在pLB Vector載體上，構建重組質粒，轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞上，涂布于Amp抗性LA平板篩選陽性克隆，送至北京擎科生物科技股份有限公司測序。篩選序列正確的陽性菌落擴大培養后提取質粒并測定質粒濃度，根據以下公式計算拷貝數：雙鏈 DNA拷貝數（copies/mL）＝6.02×1023（copies/mL）×濃度（g/mL）/ 重組質粒長度×660。

1.4 三重熒光定量PCR檢測方法及標準曲線的建立

根據重組質粒序列設計相應的引物和探針（見表2），稀釋至10 μmol，建立三重熒光定量PCR檢測方法。三重熒光定量PCR體系反應條件探索如下：Animal Detection U+ Probe Master Mix 12.5 μL，正反向引物0.2~0.8 μL，以0.1 μL遞增，探針引物0.1~0.4 μL，以0.1 μL遞增，采用矩陣法優化引物和探針的最優濃度配比。陽性對照核酸模板1 μL，用ddH2O補足25 μL反應體系。反應程序詳見QV110-01產品說明書。

表2 三重熒光定量PCR引物及探針列表

測定pLB-P72、pLB-CD2v、pLB-MGF重組質粒濃度，稀釋至（5.44~6.46）×1012copies/mL，按1∶1∶1混勻后作為陽性對照標準品，以10 倍的梯度稀釋成11個濃度，按照優化好的反應體系和條件進行多重熒光定量 PCR 擴增，以標準品濃度的對數為橫坐標，Ct 值為縱坐標建立標準曲線［用（5.44~6.46）×109copies/mL到（5.44~6.46）×105copies/mL這5個濃度梯度建立標準曲線］。

1.5 特異性試驗

以PCV2、PRV 和PPV的 DNA為模板，按照1.4優化出的條件，進行PCR擴增檢測，以評估檢測方法的特異性。

1.6 敏感性試驗

將重組質粒標準品10倍梯度（從1012-102copies/μL）稀釋后，按照1.4已優化的條件，以三個重組質粒為陽性對照，確定該方法的敏感性。

1.7 重復性試驗

以上述不同濃度的質粒標準品混合物為模板，利用本研究建立的方法檢測，每個濃度設3個生物學重復，進行組內重復性分析。將上述試驗重復3次，進行組間重復性分析，計算變異系數，分析該方法的重復性。

1.8 三重熒光定量PCR方法的驗證試驗

以廣西動物疫病預防控制中心提供的野生型ASFV及MGF-CD2v基因雙缺失的ASFV兩種樣本為驗證材料，使用P72、CD2v、MGF這3個基因的引物（表2）進行普通PCR驗證。驗證正確后使用上述兩種樣本的DNA為模板，用1.4優化出的三重熒光定量PCR來檢測，鑒別ASFV的野生毒株和MGF-CD2v基因雙缺失毒株。

2 結果

2.1 重組質粒標準品的構建

采用表1設計的引物均能擴增出大小正確的目的片段。選取ASFV-P72-F3/R3擴增產物（382 bp）、ASFV-MGF-F1/R1擴增產物（827 bp）和ASFV-CD2v-F1/R1擴增產物（548 bp）連接pLB Vector，轉化DH5α。挑選菌落PCR驗證正確的陽性克隆送測序，獲得測序正確的重組質粒pLB-P72、pLB-MGF和pLB-CD2v。

2.2 引物和探針濃度配比的優化

在引物和探針濃度均在10 μmol情況下，采用矩陣法優化引物和探針的最優濃度配比：取0.1~0.5 μL的引物，擴增效率隨引物濃度顯著提升；取0.5~0.7 μL的引物，擴增效率不再隨引物濃度提升。探針濃度在0.2 μL附近為最優。故優化后體系如下：上下游引物（10 μmol）各0.5 μL，探針（10 μmol）各0.2 μL。

2.3 標準曲線的建立

以pLB-P72（FAM通道）、pLB-CD2v（HEX通道）、pLB-MGF（CY5通道）重組質粒標準品作為陽性對照，建立標準曲線。因為從（5.44~6.46）×1012copies/mL到（5.44~6.46）×1010copies/mL以及從（5.44~6.46）×104copies/mL到（5.44~6.46）×102copies/mL這兩個濃度范圍的線性關系并不是很顯著，所以選取從（5.44~6.46）×109copies/mL到（5.44~6.46）×105copies/mL建立標準曲線。三個重組質粒的拷貝數以10為底的對數值與Ct值在上述濃度范圍有較好的線性關系（圖1）。

圖1 FAM、HEX和CY5通道的擴增曲線圖及標準曲線

2.4 特異性試驗

以PCV2 、PRV、PPV的DNA為模板，按照1.4已優化的條件進行檢測，未出現特異性擴增曲線，說明引物的特異性良好。

2.5 敏感性試驗

以pLB-P72、pLB-CD2v、pLB-MGF重組質粒標準品為模板，按照1.4已優化的條件，從（5.44~ 6.46）×1012copies/mL到（5.44~6.46×102）copies/mL濃度范圍均可以檢測出明顯的擴增曲線（圖2），其檢測閾限在（5.44~6.46）×102copies/ mL之下，其靈敏度可以達到102~103copies/mL之間。

圖2 三重熒光定量PCR擴增曲線圖

2.6 重復性試驗

對FAM、HEX和CY5三個信號通道下109、107和105這3個模板濃度下的數據進行組間的重復性比較，利用變異系數計算公式計算變異系數。結果顯示，大部分組間變異系數均小于 2%或接近2%，只有一組數據HEX和CY5二組數據稍大于2%（表3），表明該檢測方法具有較好的重復性。

表3 重復性試驗結果

2.7 三重熒光定量PCR方法的驗證

ASFV的野生毒株可擴增出P72、CD2v和MGF3個基因的所有片段，而MGF-CD2v基因雙缺失毒株僅可擴增出P72基因的片段。通過三重熒光定量PCR檢測鑒別，ASFV的野生毒株出現FAM、HEX和CY5 3個通道的擴增曲線，而MGF-CD2v基因雙缺失毒株僅有FAM通道的擴增曲線（圖3）。

圖3 三重熒光定量PCR的樣本檢測試驗

3 討論

本實驗建立的三重熒光定量PCR方法可以有效檢測ASFV，并能對ASFV的野毒株和MGFCD2v基因缺失毒株進行鑒別，檢測的敏感性為102~103copies/mL。該靈敏度已經達到目前查閱到的基于TaqMan探針的多重熒光PCR檢測企業標準（1000 copies/mL）的要求（T/GDMDMA 0001—2021）。同時我們也注意到CY5和HEX擴增效率比較低，可能與使用的Animal Detection U+ Probe Master Mix的擴增效率有關，使用擴增效率更高的Taq酶或能提高檢測精確性。

據張靜遠等報道［4］，基于P72基因設計的TaqMan探針，其對陽性重組質粒的檢測靈敏度在10 copies/μL，對已知陽性臨床組織樣品可檢至 1∶103稀釋度。據韓玉等人研究［5］，基于CD2v基因設計的TaqMan探針熒光定量檢測方法，對重組質粒的檢測閾限在16 copies/μL。而根據蔡曉麗等人所報道的P72和CD2v雙基因實時熒光定量PCR檢測方法，其檢測閾限在7.3 copies/μL~24.5 copies/μL的ASFV核酸濃度［6］。目前現行的非洲豬瘟檢測國家標準《非洲豬瘟診斷技術》（GB/T 18648—2020）僅有基于P72基因的單重探針熒光PCR方法［7］，本研究建立的基于P72、MGF和CD2v基因的三重探針熒光PCR方法可以區分野毒株和基因缺失變異株，將為兩類毒株的鑒別診斷標準的修訂提供數據支撐。綜上所述，本研究建立的基于P72、MGF和CD2v基因的TaqMan探針熒光定量檢測方法可靠有效，可為臨床應用提供科學的試驗依據。