Rap1GAP 激酶通過 AMPK 信號通路影響宮頸癌細胞增殖、侵襲及遷移的研究

李金秋，王玲，秦祥川，阿仙姑·哈斯木

新疆醫科大學基礎醫學院/新疆地方病分子生物學重點實驗室，新疆烏魯木齊 836001

子宮頸癌(cervical cancer，CC)是常見的女性惡性腫瘤之一，同時子宮頸癌作為新疆地區的高發腫瘤之一，其發病率和病死率正在逐年增加并趨向年輕化[1-2]。宮頸癌的發生發展涉及多種機制，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是目前已知的引起宮頸癌的主要原因，除此之外，CC 的發生與免疫機制、家族遺傳、性生活紊亂等因素有關[3]。目前，手術、放療、化療等治療CC 的技術取得了很大進展，新的治療方法也逐漸應用于臨床，但無法控制淋巴結的轉移仍是疾病進展、治療失敗的主要原因[4]。腫瘤細胞快速增殖和難以控制的盆腔淋巴結轉移是造成晚期宮頸癌患者死亡的主要原因[5]。

Rap1 GTP 酶激活蛋白(Rap1 GTPase-activating protein，Rap1GAP)是Rap1 的GTP 酶激活蛋白，可以使與Rap1 結合的GTP 水解為GDP，從而促進蛋白失活[6]。Rap1GAP 家族作為腫瘤抑癌基因，近些年被研究者們逐漸認識。Rap1 是Ras 家族的成員之一，是一種小分子G 蛋白，可影響細胞的增殖、黏附和血管生成等生理過程[7]。Rap1存在兩種構象，與GDP 結合后使其失活，與GTP結合后可發揮其生物學效應。Rap1 活性失調與腫瘤的發展密切相關，故調控Rap1 活性的Rap1GAP也參與腫瘤的惡性進展。已有研究顯示，Rap1GAP抑制胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移，進而顯著抑制胃癌的進展[8]。在腦膠質瘤中，Rap1GAP 表達較低，其低表達導致患者不良預后[9]。本研究旨在探索Rap1GAP 對宮頸癌細胞生物學功能的影響以及可能的分子機制，為宮頸癌的發病機制研究及提高患者預后提供一定理論基礎。

材料與方法

1 實驗材料 宮頸癌SiHa 細胞、C33a 細胞購于武漢普諾賽公司，正常宮頸上皮H8 細胞購于上海細胞庫。慢病毒由上海吉凱公司負責構建；一抗：Rap1GAP (19174-1-AP)、E-cadherin (20874-1-AP)、N-cadherin (22018-1-AP)和 β-actin (20536-1-AP)購于美國ProteintechGroup 公司；AMPK (2532S)和p-AMPK (50081S)抗體購于美國Cell Signaling Technology 公司；DMEM 和MEM (NEAA)培養基購于武漢普諾賽公司；Trizol 試劑和逆轉錄cDNA 試劑盒購于美國Themo 公司；實時熒光定量TB Green Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)的試劑盒購于日本的TaKaRa 公司；(356234) Matrigel膠購于美國的BD 公司。

2 生物信息學分析 從UCSC (https://xenabrow ser.net)數據庫中下載經統一標準化的泛癌數據集：TCGA TARGET GTEx (PANCAN，N=19 131，G=60 499)，從中提取ENSG00000076864 (RAP1GAP)基因在宮頸癌樣本中的表達數據，對每一個表達值進行log2 (x+0.001)變換，獲得該基因在宮頸癌中的表達數據。

3 細胞培養 宮頸癌SiHa (HPV16 陽性)細胞系與正常宮頸上皮H8 細胞系使用DMEM 完全培養基，宮頸癌C33a (HPV16 陰性)細胞系使用MEM(NEAA)完全培養基，上述兩種細胞所用的完全培養基均包含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素，培養于37℃、5% CO2培養箱內。

4 qRT-PCR檢測細胞Rap1GAP、E-cadherin 和N-cadherin 的基因表達水平 使用Trizol 法從細胞中提取總RNA，隨后利用逆轉錄試劑盒轉錄為cDNA 。采用試劑實時熒光定量TB Green Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)試劑盒對cDNA 擴增分析。應用β-actin 為內參基因進行歸一化處理后得到對應基因的對表達量。Rap1GAP、E-cadherin、N-cadherin 和β-actin 引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 檢測基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of genes detected by qRT-PCR

5 慢病毒轉染及分組 OE-Rap1GAP、sh-Rap1GAP慢病毒及其對照慢病毒(NC-Rap1GAP)由上海吉凱基因醫學科技股份有限公司負責構建。按照公司提供的轉染實驗手冊進行轉染實驗，將對數生長的細胞經胰酶消化并制成(5～ 6) × 104/mL 的細胞懸液，分別吸取1 mL 細胞懸液置于六孔板中，當細胞量達到50%時，棄去完全培養基換成無血清培養基饑餓培養，24 h 后棄去無血清培養基并換成含血清培養基依據轉染手冊加入對應慢病毒，轉染72 h后，用1 mg/mL 嘌呤霉素篩選轉染成功的宮頸癌SiHa、C33a 細胞，持續篩選時間為5～ 7 d 。將篩選存活下來的細胞使用2.5 μg/mL 嘌呤霉素繼續培養。

6 Western blot 檢測細胞Rap1GAP、E-cadherin、N-cadherin、AMPK 和p-AMPK 的蛋白表達水平將細胞沉淀于細胞裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑混合物中裂解30 min，將提取的蛋白樣品經10% SDS-PAGE 凝膠進行電泳分離并轉移至PVDF膜。使用5%脫脂牛奶常溫封閉1.5 h，室溫一抗孵育1 h 40 min，隨后室溫二抗(稀釋比1∶10 000)避光孵育1 h，并通過ECL 化學發光儀顯影。抗體稀釋如下：Rap1GAP (1∶800)，AMPK(1∶1 000)，p-AMPK (1∶1 500)，E-cadherin (1∶5 000)，E-cadherin (1∶4 500)，β-actin (1∶10 000)。

7 Transwell 實驗檢測細胞侵襲與遷移能力Transwell 侵襲檢測：上室加入8～ 12 mg/mL 的Matrigel 60 μL，培養箱中放置2 h，隨后向上室中加入5 × 104/200 μL 的無血清細胞懸液，下室加入600 μL 完全培養基；Transwell 遷移測定：按照上述方法將2.5 × 105個細胞置于1 mL 不含血清的培養基內，吹打混勻，吸取200 μL 的無血清細胞懸液接種于Transwell 的上室內，下室為600 μL 完全培養基(含有血清)。24 h 后取出24 孔板，使用4%多聚甲醛溶液固定細胞30 min，PBS 沖洗3次，每次5 min，使用1%結晶紫工作液室溫染色10 min，用PBS 清洗，倒置顯微鏡下觀察上室底面細胞數。

8 平板克隆實驗檢測細胞集落形成能力 使用6 孔板進行克隆形成試驗。將不同分組的細胞以2 × 103/孔的細胞密度進行培養，培養7～ 10 d 觀察集落大小和數量。

9 統計學分析數據 結果 以±s表示，使 用GraphPad Prism 7 軟件和SPSS 19.0 軟件進行統計學評估，兩組變量進行比較采用獨立樣本t檢驗，多組組間變量進行比較應用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

結果

1 Rap1GAP 在宮頸癌組織和宮頸癌細胞中的表達水平 利用數據庫觀察到Rap1GAP 在宮頸癌組織和正常宮頸上皮組織中的表達。結果顯示，與正常宮頸上皮組織相比，宮頸癌組織中Rap1GAP的表達顯著上調(P＜0.05，圖1A)。Western blot 技術在蛋白水平驗證Rap1GAP 在子宮頸癌細胞(C33a、SiHa 細胞)和正常子宮頸上皮細胞(H8 細胞)中的表達情況。結果顯示，與H8 細胞相比，Rap1GAP 在子宮頸癌C33a 細胞中高表達，在SiHa 細胞中低表達(P＜0.05；C33avsSiHavsH8：1.407 ± 0.149vs0.667 ± 0.092vs1.013 ± 0.132，F=25.236，P=0.001。圖1B)。

圖1 Rap1GAP 在宮頸癌組織和宮頸癌細胞中的表達A:數據庫中子宮頸癌組織和癌旁組織Rap1GAP 的表達水平(aP＜0.05，vs N 組)；B: Western blot 檢測Rap1GAP 蛋白在宮頸癌C33a 和SiHa 細胞以及正常宮頸上皮細胞H8 細胞中的相對表達水平(aP＜0.05，vs H8)Fig.1 Expression of Rap1GAP in cervical cancer tissues and cellsA: Expression level of Rap1GAP in cervical cancer tissues and adjacent tissues (aP＜0.05,vs N group);B: Western blotting was used to detect the relative expression levels of Rap1GAP protein in cervical cancer C33a and SiHa cells and normal cervical epithelial cells H8 cells (aP＜0.05,vs H8)

2 Western blot 驗證宮頸癌細胞轉染效率Rap1GAP 載體及對應空載體慢病毒感染C33a 和SiHa 細胞系，其中SiHa 細胞系構建OE-Rap1GAP組(Rap1GAP 高表達)與相應NC-Rap1GAP 組(空載)；C33a 細胞系構建sh-Rap1GAP 組(Rap1GAP低表達)與相應NC-Rap1GAP 組(空載)，Western blot 驗證各組細胞Rap1GAP 蛋白表達量。結果顯示，在SiHa 細胞系中，OE-Rap1GAP 組Rap1GAP表達量較SiHa 組顯著增加(1.664 ± 0.081vs1.051 ±0.124vs1.047 ± 0.06，F=44.110，P=0.001)；在C33a細胞系中，sh-Rap1GAP 組Rap1GAP 表達量較C33a組降低(0.396 ± 0.042vs1.058 ± 0.112vs1.103 ±0.091，F=62.614，P=0.001)(圖2A)。qRT-PCR 檢測結果與Western blot 結果一致(P＜0.01，圖2B)。

圖2 慢病毒轉染SiHa、C33a 細胞后各組細胞Rap1GAP 蛋白及mRNA 表達情況A：Western blot 檢測Rap1GAP 蛋白表達情況(aP＜0.01，vs SiHa)；B：qRT-PCR 檢測Rap1GAP mRNA 相對表達水平(aP＜0.01，vs C33a)Fig.2 Protein and mRNA expression of Rap1GAP in SiHa and C33a cells after lentivirus transfection in each groupA: Rap1GAP protein expression was detected by Western blot (aP＜0.01,vs SiHa);B: Rap1GAP mRNA relative expression level detected by qRT-PCR (aP＜0.01,vs C33a)

3 Rap1GAP 表達對宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響 平板克隆實驗結果表明，與SiHa 組相比，過表達Rap1GAP 的OE-Rap1GAP 組細胞集落形成顯著減弱(圖3A)。Transwell 實驗結果顯示，與SiHa 組相比，OE-Rap1GAP 組細胞侵襲和遷移能力降低(圖3B)。在C33a 細胞系中，與C33a 組相比，sh-Rap1GAP 組細胞的增殖、侵襲和遷移能力增強。結果表明，上調Rap1GAP 表達可減弱SiHa 細胞的增殖、侵襲和遷移能力。

圖3 Rap1GAP1 的表達變化對宮頸癌細胞SiHa、C33a 惡性生物學行為的影響A：細胞平板克隆實驗結果；B：侵襲實驗結果(上側)和遷移實驗結果(下側)Fig.3 Effect of Rap1GAP1 expression on malignant biological behavior of cervical cancer cells SiHa and C33aA: Results of cell plate cloning experiment;B: Invasion test results (upper side) and migration test results (lower side)

4 Rap1GAP 通過AMPK 通路調控宮頸癌細胞EMT 途徑 Western blot 和qRT-PCR 檢測上皮細胞間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)標記物相關蛋白和基因的表達。Western blot 結果顯示，與SiHa 組相比，OE-Rap1GAP 組細胞內E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達升高，而N-鈣黏蛋白(N-cadherin)的表達降低(圖4A，圖4C)。qRTPCR 檢測結果與Western blot 結果一致(P＜0.01，圖4B)。Western blot 檢測AMPK 通路相關蛋白的表達。結果顯示，與SiHa 組相比，OE-Rap1GAP組細胞內p-AMPK 的表達降低(P＜0.01，圖4A，圖4C)，而非磷酸化AMPK 表達無變化，差異無統計學意義(P＞0.05)，C33a 細胞系各組結果與其相反。

圖4 Rap1GAP 表達變化對宮頸C33a、SiHa 細胞EMT 相關蛋白的影響A：Western blot 檢測AMPK 通路中p-AMPK、AMPK 和EMT 相關蛋白的表達情況；B：qRT-PCR 檢測各個目的基因的相對表達水平(aP＜0.01,vs SiHa、C33a)；C：各個目的蛋白的相對表達水平(aP＜0.01，vs SiHa、C33a)Fig.4 Effect of Rap1Gap expression on EMT-related proteins and genes in cervical C33a and SiHa cellsA: Western blotting was used to detect the expression of P-AMPK,AMPK and EMT related proteins in AMPK pathway;B: Relative expression level of each target gene detected by qRT-PCR (aP＜0.01,vs SiHa,C33a);C: Relative expression level of each target protein(aP＜0.01,vs SiHa,C33a)

討論

2020年宮頸癌已成為全球發病率較高的婦科生殖道惡性腫瘤，在中國女性中，其發病率呈持續上升趨勢[10]。隨著宮頸癌篩查方法、HPV 疫苗的普及和治療水平的不斷提升，我國宮頸癌患者5 年生存率相比以前有所提高[11]。對于宮頸癌患者而言，腫瘤的侵襲和轉移性增強是治療不良的主要原因。因此，探究宮頸癌侵襲、轉移等分子機制，對于尋找新的治療靶點，提高患者的生存率具有重要的意義。

如前文所提到Rap1GAP 作為腫瘤抑癌基因，Rap1GAP 是Rap1 的GTP 酶激活蛋白，可促使與Rap1 結合的GTP 水解為GDP，從而促進該蛋白失活。Rap1 作為小分子G 蛋白，可調控細胞的多種生物學功能，如增殖、分化和細胞黏附等[12-13]。已有研究證實，Rap1GAP 作為抑癌蛋白在甲狀腺癌中呈低表達趨勢，可調節腫瘤細胞的多種周期蛋白，從而抑制細胞增殖，具體機制尚不清楚[14]。另一項研究中Rap1GAP 可抑制子宮內膜癌的進展，降低Rap1GAP 表達可上調Rap1 活性，增強EAC 細胞的遷移和侵襲能力[15]。本研究利用數據庫從中提取ENSG00000076864 (RAP1GAP)基因在宮頸癌樣本中的表達數據，發現Rap1GAP 在宮頸癌組織中呈高表達趨勢，這與上述研究結果不一致，故進一步檢測Rap1GAP 蛋白在宮頸癌細胞中的表達水平，結果顯示，與正常宮頸上皮細胞H8相比，Rap1GAP 在宮頸癌HPV16 陽性的SiHa 細胞中表達相對較低，在HPV 陰性的C33a 細胞中表達相對較高，提示Rap1GAP 的表達與HPV 病毒感染有關。

已有研究證明，Rap1GAP 在宮頸癌組織和細胞中的表達與HPV 感染有關。在人類乳頭瘤病毒感染的細胞中，E6TP1 作為與HPV16 E6 相互作用的靶蛋白，其羧基末端存在40 個氨基酸殘基與HPV16 E6 結合，發生泛素化，蛋白酶降解，激活Rap1 通路，導致腫瘤形成[16-17]。文獻指出，Rap1GAP 在宮頸癌Hela 細胞中表達相對較低，增強細胞的遷移能力[18]。在本研究中，通過上調Rap1GAP 表達，導致細胞中與EMT 相關的蛋白E-cadherin 表達升高，N-cadherin 表達降低，抑制細胞的增殖、侵襲和遷移能力，該結果與文獻報道一致，提示上調Rap1GAP 表達可抑制宮頸癌細胞發生EMT，但具體機制尚不清楚。AMPK 作為經典的信號轉導通路，其異常活化將導致腫瘤細胞的多種生物學改變，包括促進腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移等。研究顯示，子宮頸癌GJB2 高表達通過抑制AMPK 的磷酸化促進宮頸癌細胞增殖和遷移[19]。細胞因子Irisin 可通過激活AMPK 緩解高糖誘導的骨髓間充質干細胞發生[20]。三羥基異黃酮通過激活AMPK 信號通路導致宮頸癌Caski細胞周期G1 期阻滯，并誘導其凋亡[21]。可見腫瘤細胞的增殖、凋亡和轉移與AMPK 通路異常激活密切相關。然而，Rap1GAP 對宮頸癌EMT 的具體調控機制鮮有報道。本研究中，上調Rap1GAP的表達后，Western blot 結果顯示p-AMPK 表達顯著降低；下調Rap1GAP 表達后，p-AMPK 表達顯著上升，AMPK 無變化。因此推測Rap1GAP 通過改變EMT 途徑影響宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移，該過程與異常的AMPK 信號通路有關。

綜上所述，Rap1GAP 在宮頸癌組織和宮頸癌細胞中呈低表達趨勢，過表達Rap1GAP 通過抑制AMPK 的磷酸化而抑制宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移。但本研究仍存在不足之處，缺少體內驗證實驗和AMPK 通路中的恢復實驗，因此后續會進一步分析Rap1GAP 調控AMPK 通路的具體分子機制，為Rap1GAP 作為宮頸癌生物學行為的潛在分子標志物提供醫學理論基礎。

致謝 感謝UCSC (https://xenabrowser.net)數據庫宮頸癌數據共享。

作者貢獻阿仙姑·哈斯木：總體構思，整體設計，審讀和修正；李金秋：研究構思，實驗實施，分析數據，論文撰寫；王玲、秦祥川：查閱部分文獻，數據收集和整理。

利益沖突本文作者聲明無利益沖突。

數據共享聲明原始數據可通過Email：axia ngu75@126.com 向通信作者申請。