地西他濱對AML1-ETO 陽性急性髓系白血病細胞中PD-L2 分子表達的影響

李夢月，邵楊柳，李雨晴，王莉莉，高曉寧

1 解放軍總醫院第五醫學中心血液病醫學部，北京 100071；2 解放軍醫學院，北京 100853；3 解放軍總醫院第一醫學中心血液科，北京 100853

t(8；21)(q22；q22)染色體易位是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)最常見的細胞遺傳學異常之一，AML-ETO(A/E)是t(8；21)染色體易位所產生的一種異常融合基因，已被發現與AML 中特異性DNA 甲基化模式相關[1]，介導相關靶基因沉默。程序性細胞死亡蛋白-1(programmed cell death protein 1，PD-1)是一種主要在活化T 細胞中表達的免疫抑制受體。程序性細胞死亡蛋白-配體2(programmed cell death-ligand 2，PD-L2)作為PD-1 的配體，與之結合后活化免疫檢查點信號通路，對抗T 細胞受體提供的激活信號，發揮免疫抑制作用[2]，導致T 細胞耗竭和免疫逃逸，促進AML 難治/復發[3]。

DNA 甲基轉移酶抑制劑地西他濱(decitabine，DAC)作為一種DNA 去甲基化藥物(hypomethylating agent，HMA)，已被應用于治療AML 及骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)[4-5]。目前已有多個HMA 聯合免疫檢查點抑制劑治療AML 的臨床研究[6-7]。我們根據前期生物信息學分析推測，PD-L2 基因啟動子區富含CG 位點，故其表達可能受DNA 甲基化調控。本研究分析了A/E陽性AML 細胞系中，PD-L2 啟動子甲基化水平及DAC 處理對其表達的影響；并比較了沉默或表達A/E 的細胞系中，DAC 處理對PD-L2 mRNA 表達影響的差異，初步探索A/E 陽性AML 細胞中DNA 甲基化對PD-L2 表達的調控作用，為未來將HMA 與PD-1 抑制劑聯合用于復發難治t(8；21)AML 的治療提供理論依據。

材料與方法

1 材料、試劑與儀器 RPMI Medium 1640 細胞培養基(Gibco)，100 × 青霉素-鏈霉素溶液(Biosharp：BL505A)，胎牛血清(Gibco)，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO；Solarbio：DB 371)，DAC(5-氮雜-2’-脫氧胞苷；Merck：A3656)，ZnSO4溶液(儲存濃度：100 mmol/L)，快速逆轉錄試劑盒(上海奕杉生物科技公司：RT001)，TRIzol?Reagent (Ambion：15596026)，通用型 KAPA SYBR?FAST qPCR (Roche)，Wizard? Genomic DNA Purification Kit (Promega：A1120)，GoTaq?Green Master Mix (Promega：M7122)，EpiTect?Bisulfite Kits (Qiagen：59104)，(BM) Gelred 核酸染料(10 000 ×)、6 × DNA Loading Buffer、50 bp Ladder DNA Marker(北京博邁德基因技術有限公司)。細胞培養箱(Thermofisher)，GeneQuant pro紫外/可見光分光光度計(Biochrom)，PCR 擴增儀(Applied Biosystems：96 Well Thermal Cycler)，實時熒光定量PCR 儀(Stratagene：3000P)，電泳儀(北京六一生物科技有限公司：DYY-6C型)，全自動數碼凝膠圖像分析系統(上海天能科技有限公司：Tanon 1600)。

2 細胞來源與培養 A/E 陽性AML 細胞系Kasumi-1，穩定沉默A/E 的細胞系SKNO-1-siA/E及其空載體對照SKNO-1-PGK(A/E 陽性)，穩定轉染A/E 表達載體的U937A/E 及其空載體對照U937-MT 細胞系均由解放軍總醫院第一醫學中心血液科實驗室凍存。U937A/E 細胞系常規培養下僅有微量A/E 蛋白表達，經100 μmol/L 的ZnSO4處理后可使A/E 過表達[8]。細胞復蘇后懸于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養液(含100 U/mL 青霉素和100 mg/L 鏈霉素，pH 值調至7.2～ 7.4)中，置于37℃、5% CO2培養箱中常規孵育，每2～ 3 d換液，分瓶傳代繼續培養。取對數生長期的細胞用于后續實驗。

3 細胞加藥處理 取對數生長期的Kasumi-1 或SKNO-1-PGK 或SKNO-1-siA/E 細胞3 × 106個置于培養皿，培養液終體積10 mL，共取4皿。分別向4 皿Kasumi-1 細胞中加入終濃度為0 μmol/L(對照組，采用終濃度為0.1% DMSO)、0.25 μmol/L、1.0 μmol/L 和2.5 μmol/L 的DAC，使4 皿細胞樣品中DAC 藥物濃度依次遞增。將加藥處理后的細胞混勻后置于培養箱內，每孵育24 h 收集細胞重新換液并加藥，至72 h 后收集細胞進行后續硫化修飾后測序(bisulfite sequencing，BSP)和逆轉錄實時定量PCR(quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR)實驗。U937-MT、U937A/E、U937A/E +ZnSO4細胞系只設置對照組與2.5 μmol/L DAC 處理組，余步驟同前。U937A/E+ZnSO4細胞系中ZnSO4濃度為100 μmol/L，每孵育24 h 收集細胞重新換液加入ZnSO4及藥物。

4 DNA 提取、BSP 檢測甲基化水平 收集適量處理后的Kasumi-1、SKNO-1-PGK 細胞，按Wizard?Genomic DNA Purification Kit 說明書提取總DNA，用紫外分光光度計以DNA260/280的比值進行DNA樣品的純度判定與濃度測定。DNA 純度和濃度合格者利用EpiTect?Bisulfite Kits 進行DNA 的亞硫酸氫鹽處理及純化回收。利用DNA 模板、PD-L2 BSP 引物、GoTaq?Green Master Mix 進行BSP 反應，反應體系為25 μL，擴增條件：95℃預變性2 min；然后95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進行35 個循環，最終72℃延伸5 min。采用MethPrimer 軟件(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer2)對PD-L2 基因轉錄起始位點及上游2 000 bp 的序列進行CpG 位點分析，并設計BSP 引物，所用引物如下，PD-L2 BSP 上游引物：5'-AGAGAATGGTAATTTTTAAGGAAAT-3'；PD-L2 BSP 下游引物：5'-AACCTAAATAATCAAT CCTTCTCCTAC-3'，產物長度400 bp，引物由北京博邁德基因技術有限公司合成。將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳以鑒定、分離DNA，交由北京博邁德基因技術有限公司進行TA 克隆與產物測序(每種細胞系各篩選20 個菌落進行測序)，以進行DNA 甲基化分析。

5 總RNA 提取及RT-qPCR檢測mRNA表達收集處理后的Kasumi-1、SKNO-1-PGK、SKNO-1-siA/E、U937-MT、U937A/E、U937A/E+ZnSO4細胞，Trizol 一步法提取細胞總RNA。用紫外分光光度計以RNA260/280的比值進行RNA 樣品的純度判定與濃度測定。RNA 純度和濃度合格者使用RNA 快速逆轉錄試劑盒制備cDNA，KAPA SYBR?FAST qPCR 試劑盒完成RT-qPCR 檢測。以GAPDH作為內參基因，反應體系為20 μL，擴增條件：95℃預變性20 s；然后95℃變性3 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，共進行40 個循環，最終72℃延伸15 min。引物由北京博邁德基因技術有限公司合成，所用引物如下，GAPDH 上游引物：5'-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3'，GAPDH 下游引物：5'-GGTGGAATCATATTGGAACA-3'。PDL2 上游引物：5'-ATTGCAGCTTCACCAGATAGC-3'，PD-L2 下游引物：5'-AAAGTTGCATTCCAGG GTCAC-3'。反應結束后根據熔解曲線判斷擴增產物，記錄各組Ct值，目的基因相對表達量應用2-△△Ct公式計算，△△Ct=(Ct 處理組目的基因 -Ct處理組內參基因) -(Ct 對照組目的基因 -Ct 對照組內參基因)，比較mRNA 的相對表達含量。每組實驗獨立重復3次。

6 生物信息學及統計學分析 利用JASPAR 數據庫(http://jaspar.genereg.net)預測PD-L2 基因啟動子區域轉錄因子結合位點。本研究所有數據均采用SPSS 21.0 統計軟件進行分析，計量資料以±s表示，兩組間量的比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間差異比較使用多組計量資料的秩和檢驗(K-W檢驗)，P＜0.05 為差異有統計學意義。影響性分析采用直線回歸分析，以決定系數r2表示，r2越接近1，引入相關的效果越好。采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行作圖。

結果

1 A/E 陽性AML 細胞系PD-L2 DNA 啟動子區特異性位點的甲基化水平及DAC 處理后的水平變化 生物信息學分析顯示，在PD-L2 基因轉錄起始位點上游2 000 bp 及5’端非翻譯區可預測到7 個潛在的轉錄因子AML1 結合位點，啟動子序列分析后顯示PD-L2 啟動子區富含CG 位點(圖1)，故PD-L2 基因表達可能分別受A/E 和DNA 甲基化調控。為明確PD-L2 基因啟動子區是否受DNA甲基化調控，采用BSP 檢測對照組(0.1% DMSO)及2.5 μmol/L DAC 處理的Kasumi-1 和SKNO-1-PGK 細胞系中PD-L2 DNA 啟動子區特異性位點的甲基化水平，測序結果顯示，PD-L2 DNA 啟動子區呈高甲基化水平(Kasumi-1 和SKNO-1-PGK 分別為94.3%、88.6%)，DAC 處理后DNA 甲基化水平下降(Kasumi-1 和SKNO-1-PGK 分別為90.7%、83.6%)，見圖2。

圖1 JASPAR 數據庫預測PD-L2 基因啟動子區存在潛在轉錄因子AML1 結合位點(A)；啟動子序列分析顯示PD-L2 基因啟動子區富含CG 位點(B)Fig.1 JASPAR database predicts the presence of potential transcription factor AML1 binding sites in PD-L2 gene (A);Promoter sequence analysis shows that the promoter region of PD-L2 gene is enriched with CG sites (B)

圖2 A/E 陽性AML 細胞系PD-L2 DNA 啟動子區特異性位點的甲基化水平及DAC 處理后的水平變化(黑圈和空圈分別代表甲基化和非甲基化CpG 二核苷酸)(A)；DAC 處理前后PD-L2 BSP 擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖(B)；DAC 處理前后PD-L2 DNA 啟動子區基因組測序序列圖(C)Fig.2 Methylation level of PD-L2 DNA promoter region specific sites in A/E positive AML cell lines and changes in the level after decitabine treatment (A);Agarose gel electrophoresis of PD-L2 BSP amplification products before and after decitabine treatment (B);Sequencing of PD-L2 DNA promoter region genome before and after decitabine treatment (C)

2 DAC 對A/E 陽性AML 細胞系PD-L2 mRNA表達的影響 RT-qPCR 檢測對照組(0.1% DMSO)及2.5 μmol/L DAC 處理后細胞系中PD-L2 mRNA水平。結果顯示，2.5 μmol/L 濃度組PD-L2 mRNA的相對表達水平(Kasumi-1：4.75 ± 1.13；SKNO-1-PGK：3.52 ± 0.87；SKNO-1-siA/E：4.78 ± 0.54；U937-MT：3.09 ± 0.85；U937A/E：29.18 ± 23.90；U937A/E+ZnSO4：1.31 ± 0.22)顯著高于對照組(Kasumi-1：1，P=0.007，t=6.623；SKNO-1-PGK：1，P=0.010，t=5.791；SKNO-1-siA/E：1，P＜0.001，t=15.656；U937-MT：1，P=0.051，t=4.256；U937A/E：1，P=0.034，t=2.888；U937A/E+ZnSO4：1，P=0.037，t=3.087)。見圖3。

圖3 DAC 對A/E 陽性AML 細胞系PD-L2 mRNA 表達的影響Fig.3 Effect of decitabine on PD-L2 mRNA expression in A/E positive AML cell lines

3 沉默或過表達A/E 后DAC 對A/E 陽性AML細胞系PD-L2 mRNA 表達的影響 RT-qPCR 檢測SKNO-1-PGK 和 SKNO-1-siA/E 細胞系 PD-L2 mRNA 表達量，結果顯示，后者在沉默A/E 后細胞PD-L2 mRNA 表達水平上升(SKNO-1-siA/E 細胞系PD-L2 mRNA 表達量較SKNO-1-PGK 升高129.1%)，見圖4A。RT-qPCR 檢測U937-MT 和U937A/E 細胞系PD-L2 mRNA 表達量，結果顯示，后者在表達A/E 后細胞PD-L2 mRNA 表達水平降低(U937A/E 細胞系PD-L2 mRNA 表達量較U937-MT 下降60.9%)，見圖4B。RT-qPCR 檢測對照組(0.1% DMSO)及2.5 μmol/L DAC 處理后的兩對A/E 沉默(SKNO-1-PGK，SKNO-1-siA/E)/誘導細胞系(U937A/E，U937A/E+ZnSO4)的PD-L2 mRNA 水平，結果顯示，2.5 μmol/L DAC 處理后，SKNO-1-siA/E 細胞中PD-L2 mRNA 相對表達水平上升幅度高于SKNO-1-PGK 細胞(SKNO-1-siA/E 與SKNO-1-PGK 相比上升35.80%)，U937A/E+ZnSO4細胞中則顯著低于U937A/E 細胞(U937A/E+ZnSO4與U937A/E 相比下降95.51%)，即A/E 沉默/低表達細胞中PD-L2 mRNA 的表達水平高于同組A/E陽性/過表達細胞(處理組SKNO-1-siA/Evs處理組SKNO-1-PGK，P=0.031；處理組U937A/E +ZnSO4vs處理組U937A/E，P=0.036)，見圖5。

圖4 沉默(A)或表達(B)A/E 后細胞PD-L2 mRNA 表達水平的變化(PD-L2 mRNA 表達量=2-△△Ct)Fig.4 Changes in expression level of PD-L2 mRNA after silencing(A) or expression (B) of A/E (PD-L2 mRNA expression=2-△△Ct)

圖5 沉默(A)或過表(B)A/E 后DAC 對A/E 陽性AML 細胞系PD-L2 mRNA 表達的影響Fig.5 Effect of DAC on PD-L2 mRNA expression in A/E-positive AML cell lines after silencing (A) or overexpression (B) of A/E

4 不同濃度DAC 對A/E 陽性AML 細胞系PDL2 mRNA 表達的劑量影響 RT-qPCR 檢測對照組(0.1% DMSO)及不同濃度(0.25 μmol/L、1.0 μmol/L和2.5 μmol/L) DAC 處理后的A/E 陽性AML 細胞系Kasumi-1、SKNO-1-PGK 中PD-L2 mRNA 水平。RT-qPCR 檢測結果顯示，在Kasumi-1、SKNO-1-PGK 細胞系中PD-L2 mRNA 的表達水平隨DAC濃度增加而升高(Kasumi-1：r2=0.992；SKNO-1-PGK：r2=0.963；SKNO-1-siA/E：r2=0.991)，呈劑量依賴性，見圖6。由于各獨立樣本未滿足方差分析條件，采用多組計量資料秩和檢驗(K-W 檢驗)，各組間差異有統計學意義(Kasumi-1：P=0.002，χ2=14.328；SKNO-1-PGK：P=0.002，χ2=14.328；SKNO-1-siA/E：P=0.001，χ2=17.561)。

圖6 A/E 陽性AML細胞系Kasumi-1 (A)、SKNO-1-PGK (B)、SKNO-1-siA/E (C) PD-L2 mRNA 的RT-qPCR 熔解曲線圖及不同濃度DAC 對各細胞系PD-L2 mRNA 表達的影響(各細胞系的各組間差異存在統計學意義)Fig.6 RT-qPCR dissociation curve of PD-L2 mRNA and effect of different concentrations of decitabine on PD-L2 mRNA expression in A/E positive AML cell lines: Kasumi-1 (A),SKNO-1-PGK (B),SKNO-1-siA/E (C) (The differences between the groups of different cell lines were statistically significant)

討論

t(8；21) AML 是一種具有基因及表觀遺傳學改變的克隆性疾病，占新診斷AML 病例的7%～12%[9-10]，其生物異質性對預后判斷和治療選擇至關重要[11]。t(8；21) AML 屬于預后相對較好類型，與過去相比，超過80%的患者在強化化療后獲得完全緩解，但仍有約40%達到完全緩解的患者出現復發，復發的中位時間為2.5年[12-13]，一旦復發，則預后很差[14-15]。研究顯示，單獨應用HMA 治療復發/難治AML 患者的平均應答率不足20%[16-17]，且耐藥情況比較普遍[5,18]。因此，開發新的HMA 聯合用藥方案，提高應答率和降低耐藥性具有重要臨床意義。HMA 通過使DNA 去甲基化，重新激活被DNA 甲基化沉默的抑癌基因，是其發揮作用的關鍵機制[19-20]。研究顯示，白血病患者經HMA 治療后，白血病細胞表面免疫檢查點分子PD-1、PD-L1、PD-L2 和CTLA4 基因表達增加，PD-L2 上調者生存期短[21]。已知免疫檢查點抑制劑，如PD-1 抑制劑，可以通過結合免疫檢查點分子而抑制PD-1/PD-L1/2 信號通路活化，進而激活細胞毒性T 細胞，起到殺傷白血病細胞的作用[22]。上述機制為將HMA 與免疫檢查點抑制劑聯合應用于白血病的治療奠定了理論基礎。免疫逃逸是AML 難治復發的重要分子機制，免疫檢查點PD-1 與其配體PD-L1/2 相互作用，顯著抑制T 細胞增殖和細胞因子產生[23]，使腫瘤向T 細胞發出負性信號，誘導T 細胞耗竭[24-26]，促進免疫逃逸。近年來，盡管已有將HMA 與PD-1 抑制劑聯合用于難治復發AML 治療的臨床研究[6]，但應答率僅為30%左右。如果我們能夠預測哪一類患者更可能會獲益于這種治療，將有助于指導個體化治療。

通過BSP 分析，我們證實了在A/E 陽性AML細胞系中，PD-L2 DNA 啟動子區的確呈DNA 高甲基化分布，DNA 甲基轉移酶抑制劑DAC 可使其去甲基化，提示A/E 陽性AML 細胞中PD-L2基因的表達很可能受DNA 甲基化調控。為進一步證實DAC 對A/E 陽性AML 細胞PD-L2 分子表達的影響，我們檢測了DAC 處理前后PD-L2 基因mRNA 表達變化，證實去甲基化處理可使細胞PD-L2 基因mRNA 表達呈濃度依賴性增加，提示A/E 陽性細胞中PD-L2 基因的表達受DNA 甲基化調控。已報道的研究和本項目組的研究結果均顯示，A/E 融合蛋白中的AML1 結構域可與野生型轉錄因子AML1 競爭靶基因上相應結合位點[27]，而ETO 通過其鋅指結構域募集轉錄抑制復合物，進而促進DNA 甲基化和組蛋白去乙酰化，導致靶基因表達沉默[28-32]。已報道的臨床研究顯示，DAC 治療使AML 細胞PD-L2 基因表達增加，與DAC 濃度呈正相關，DAC 治療可使MDS/AML 患者PD-L2 mRNA 表達增加，且PD-L2 表達上調者的總體生存率低于PD-L2 表達不上調者，PD-L2的高表達與AML 患者總體生存不佳相關[21,33]。這與我們的實驗結果一致，提示去甲基化藥物誘導的A/E 陽性AML 中PD-L2 的上調參與了AML 的發展，并可能與AML 患者的HMA 治療抵抗相關。

為進一步分析A/E 陽性AML 中PD-L2 與DNA 基化調控的關系，我們進一步對比了沉默或過表達A/E 的細胞系對DAC 誘導PD-L2 mRNA表達作用的差異，我們發現沉默A/E 的SKNO-1-siA/E 細胞中PD-L2 mRNA 表達水平更高，過表達A/E 的U937A/E 細胞中PD-L2 mRNA 表達水平較低，提示A/E 可能介導了PD-L2 的DNA 甲基化沉默。此外，對于A/E 表達水平不同的細胞，DAC 處理后其PD-L2 mRNA 的表達水平變化也有所差異，表現在雖然DAC 可誘導多個A/E 陽性AML 細胞系PD-L2 表達上調，但A/E 陰性/低表達細胞PD-L2 mRNA 表達水平上升幅度顯著高于同組A/E 陽性/過表達細胞，加之PD-L2 基因存在可能的AML1 結合位點，提示A/E 可能通過募集轉錄抑制復合物參與介導了PD-L2 基因的DNA 甲基化沉默。文獻報道，t(8；21)染色體重排的存在和A/E 融合基因的產生，在白血病中存在預測不同患者結局的特定DNA 甲基化譜[1]，其潛在機制涉及A/E 與DNA 甲基轉移酶和某些轉錄因子形成復合物，以抑制目標腫瘤抑制基因[8]。

綜上，我們的實驗驗證了先前的推測，即A/E 陽性AML 細胞中PD-L2 基因的表達受DNA甲基化調控，這為下一步研究A/E 融合蛋白對PD-L2 表達的直接或間接調控作用奠定了基礎。闡明A/E 與PD-L2 基因之間的表達調控關系可為未來將HMA 和PD-1 抑制劑聯合用于t(8；21)AML 的治療提供理論依據。

作者貢獻李夢月：實驗設計者和實驗研究執行人，完成數據分析，論文初稿的寫作與修改；邵楊柳：提供實驗技術督導，參與實驗結果分析；李雨晴：在實驗材料準備及數據核對方面給予幫助；王莉莉：提供實驗環境及實驗設備；高曉寧：項目的構思者及負責人，指導實驗設計、數據分析、論文審閱。全體作者閱讀并同意最終版論文。

利益沖突所有作者聲明沒有利益沖突。

數據共享聲明本研究中生物信息學資料來源于公共數據庫(http://jaspar.genereg.net)，其余支持研究結果的數據可由相應的作者在合理要求下聯系通信作者獲得。