陰道微生態改變與高危型人乳頭瘤病毒感染的相關性研究

李莉，馬瑩，付玉榮，于東渤，王銘洋，鄭文瑾，翟青枝

解放軍總醫院第一醫學中心婦產科，北京 100853

女性陰道微生態是由陰道微生物菌群、宿主的內分泌系統、陰道解剖結構及陰道局部免疫系統共同組成的生態系統[1]，具有動態變化特征，并受月經、年齡、雌激素水平、性交頻率等多種因素影響。正常陰道微生物群能維持陰道正常酸性環境，抑制病原體生長，一旦菌群結構失衡，就會增加生物個體感染各種生殖系統疾病的風險[2]。已有研究表明陰道微生態環境失衡與宮頸鱗狀上皮內病變(squamous intraepithelial lesion，SIL)甚至宮頸癌變的發生發展有關[3]。高危型人乳頭瘤病毒(high risk human papillomavirus，HR-HPV)持續感染是宮頸發生癌前病變甚至進展為癌變的主要原因[4]。陰道微生態是HPV 入侵宮頸的第一道防線，HR-HPV 感染可能與機體陰道微生態平衡存在一定的相關性。本研究旨在分析陰道微生態指標與HR-HPV 感染的相關性，以期為宮頸癌的防治提供參考。

資料與方法

1 資料 收集2021 年10 月-2022 年3 月于解放軍總醫院第一醫學中心婦產科同時行陰道分泌物微生態及人乳頭瘤病毒基因分型檢測的病例324例。納入標準：(1)有性生活史，知情同意并配合者；(2) 24 h 內無性生活、盆浴、陰道灌洗及局部上藥等；(3)近兩周內未使用過抗生素。排除標準：(1)月經期或不規則陰道出血；(2)妊娠期或哺乳期；(3)合并或繼發其他腫瘤、嚴重婦科疾病及內分泌系統疾病；(4)意識不清及不能配合者。本研究通過解放軍總醫院倫理委員會批準(No.S2021-168-01)，所有研究對象均知情同意，所有檢測均在本科實驗室完成。

2 陰道微生態檢測 標本采集：受檢者取膀胱截石位，少量0.9%氯化鈉注射液潤滑窺陰器后放入陰道內，充分暴露陰道壁和宮頸，用無菌棉拭子在陰道側壁的上1/3 處刮取適量分泌物，置入試管。

檢測方法：采用湖南友哲科技有限公司自主研發的全自動GY66 陰道微生態檢測儀及配套的陰道炎聯合檢測試劑盒(酶化學反應法)進行檢測。經過自動加樣、自動制片染色、試紙功能學顏色判讀、智能聚焦與深度識別分類計數等流程后，得到形態學分析結果及功能學分析結果，經GY6.01 軟件進行綜合分析最終判讀。

3 人乳頭瘤病毒基因分型檢測 標本采集：體位同前。暴露宮頸，以無菌棉拭子擦去子宮頸口過多分泌物，專用子宮頸刷置于宮頸管內，以順時針方向轉動5 圈的方式在受檢者宮頸鱗柱交界處采集脫落上皮細胞，置入裝有HPV 保存液的標本瓶中。

檢測方法：采用上海之江生物科技股份有限公司生產的HPV 分型核酸測定試劑盒及SLAN-96S實時熒光定量PCR 檢測系統，經核酸提取、基因擴增等流程，對15 種HPV 高危亞型(16，18，56，45，35，59，39，51，58，52，31，33，68，66和 82)的特異性DNA 核酸片段進行分型檢測。

4 全自動GY66 陰道微生態檢測儀結果判讀 微生態正常：陰道菌群密集度為++/+++、菌群多樣性為++/+++、優勢菌為乳桿菌、pH 為3.8～ 4.5、功能學指標(包括多胺、唾液酸苷酶、白細胞酯酶等)陰性、Nugent 評分為0～ 3 分、AV 評分為0～ 2 分；

微生態異常參照陰道微生態評價的臨床應用專家共識[1]，報告分為陰道微生態正常和陰道微生態異常，異常包括菌群抑制、細菌性陰道病(bacterial vaginosis，BV)、BV 中間型、滴蟲性陰道炎(trichomonas vaginitis，TV)、需氧菌性陰道炎(aerobic vaginitis，AV)、外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginal candidiasis，VVC)、微生態菌群正常存在炎癥反應等。

5 SLAN 熒光定量PCR 檢測系統結果判讀 檢測試劑：分為混合液1(16、56、31型+IC)、混合液2(18、52、58、68型)、混合液3(45、82、33、35型)、混合液4(39、51、59、66型)。

檢測結果判讀：(1)當待檢樣本經FAM 通道、VIC 通道、610 通道、Cy5 通道檢測后Ct 值≤38，且擴增曲線呈典型的S形，則判斷為對應型別的陽性；(2)當待檢樣本在混合液1 的CY5 通道Ct 值≤32，且在混合液1 的其余通道以及其余混合液的各通道Ct 欄都顯示NO Ct，檢測樣本判定為陰性；(3)當待檢樣本Ct 值為38～40，需重復測定，如仍在38～ 40 范圍內，且擴增曲線呈典型的S形，則判斷為陽性，若呈非典型的S形，則判斷為陰性。

6 分析指標 選取陰道微生態異常指標中樣本量大于30 的BV 及BV 中間型組、菌群抑制組、菌群正常存在炎癥反應組，分別與微生態正常組的HR-HPV 陽性率進行比較。

7 統計學分析 采用SPSS 26.0 軟件進行數據分析。計數資料用例數(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗；危險因素進行logistic 回歸分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 陰道微生態異常組與陰道微生態正常組的HRHPV 陽性率比較 同時行陰道微生態及HPV 檢測的324 例患者，年齡21～ 72歲。HR-HPV 陽性71例，陽性率為21.91%(71/324)。陰道微生態異常的146 例患者(年齡21～ 72 歲)中HR-HPV 陽性28例，陽性率為19.18%(28/146)，陰道微生態正常的178 例患者(年齡21～ 68 歲)中HR-HPV陽性43例，陽性率為24.16%(43/178)，兩組差異無統計學意義(χ2=1.162，P=0.281)。見表1。

表1 陰道微生態異常組與正常組HR-HPV 陽性率比較Tab.1 Comparison of positive rate of HR-HPV between the abnormal vaginal microecology group and the normal group

2 BV 及BV 中間型組與陰道微生態正常組的HR-HPV 陽性率比較 BV 及BV 中間型組HR-HPV陽性37例，陽性率40.54%(15/37)，顯著高于陰道微生態正常組，兩組差異有統計學意義(χ2=4.174，P=0.041)。見表2。

表2 BV 及BV 中間型組與陰道微生態正常組HR-HPV 陽性率比較Tab.2 Comparison of positive rate of HR-HPV between the BV/intermediate BV group and normal group and the normal vaginal microecology group

3 菌群抑制組與陰道微生態正常組的HR-HPV陽性率比較 菌群抑制組HR-HPV 陽性32例，陽性率18.75%(6/32)，與陰道微生態正常組比較，差異無統計學意義(χ2=0.443，P=0.506)。見表3。

表3 菌群抑制組與陰道微生態正常組HR-HPV陽性率比較Tab.3 Comparison of positive rate of HR-HPV between the flora inhibition group and the normal vaginal microecology group

4 陰道菌群正常存在炎癥反應組與陰道微生態正常組的HR-HPV 陽性率比較 陰道菌群正常存在炎癥反應組HR-HPV 陽性77例，陽性率9.09%(7/77)，顯著低于陰道微生態正常組，兩組差異有統計學意義(χ2=7.740，P=0.005)。見表4。

表4 陰道菌群正常存在炎癥反應組與陰道微生態正常組HR-HPV 陽性率比較Tab.4 Comparison of positive rate of HR-HPV between the normal vaginal flora+inflammatory reaction group and the normal vaginal microecology group

5 HR-HPV 感染作為因變量進行logistic 回歸分析 采用logistic 回歸(向前LR，進入P＜0.05，排除為P＞0.10)進行自變量的選擇和剔除。回歸結果顯示BV 及BV 中間型是HR-HPV 感染的危險因素(OR=2.240，P=0.030)，陰道菌群正常存在炎癥反應是HR-HPV 感染的保護因素(OR=0.329，P=0.009)。見表5。

表5 Logistic 回歸分析HR-HPV 感染的影響因素Tab.5 Logistic regression analysis of influencing factors of HR-HPV infection

討論

女性陰道微生物菌群種類多、數量大，菌群與菌群之間相互制約、相互作用、相互依賴，維持陰道微生態動態平衡[5]。正常情況下，乳桿菌是陰道微生物中的優勢菌，可分解陰道上皮細胞內糖原，生成乳酸使陰道的pH 值下降，從而維持弱酸性環境起到保護的作用，還能夠產生過氧化氫，使陰道免受病原體和其他非正常定植微生物的感染[6]。HPV 在低pH 環境下難以高效存活，故正常的陰道酸性環境本身就有利于清除HPV 或延緩其復制。

越來越多的研究表明，陰道微生態失衡會繼發下生殖道感染，破壞防御屏障會增加HPV 感染概率，而HPV 的持續感染與宮頸上皮內瘤變及子宮頸癌的發生密切相關。中華醫學會婦產科學分會感染性疾病協作組推薦采用陰道微生態評價系統對下生殖道感染進行檢測[7]。本實驗室采用全自動GY66 陰道微生態檢測儀統一判讀陰道微生態結果，前期研究顯示其與傳統的人工鏡檢方法一致性好，還能避免常規鏡檢因人為主觀因素造成的漏檢和誤判，提高了陰道分泌物分析的效率和質量[8]。

BV 是臨床常見的陰道內正常菌群失調導致的混合感染，是由乳桿菌減少或消失，厭氧菌、陰道加德納菌等增多引起的陰道微生態失調綜合征[9]。BV 患者陰道分泌物中存在大量黏蛋白降解酶，導致陰道pH 升高，局部黏膜屏障被破壞后，病毒黏附增加，大量繁殖甚至整合進宿主基因組，從而增加HPV 感染的易感性[10]。此外，HPV 可通過皮膚黏膜微損傷入侵鱗狀上皮基底層細胞，陰道內的普氏菌屬和類桿菌可產生神經氨酸酶，其作用是協助成熟的病毒顆粒脫離宿主細胞，進而感染新的上皮細胞，造成病毒在患者體內的擴散[11]。研究表明，BV 患者陰道分泌物中的厭氧菌代謝會釋放有致癌作用的亞硝基胺，存在高濃度的磷脂酶A2 可增加HPV 的易感性，也就增加了病毒潛伏期和清除難度[12]。本研究中BV 組HR-HPV 陽性率顯著高于陰道微生態正常組。BV 所引起的菌群失調增加了HPV 的感染率。前期研究證實，從HR-HPV 感染到各級別宮頸上皮內病變的患者，其陰道分泌物中加德納菌豐度顯著增高，且與疾病進展相關[13]。很多學者的研究發現，HPV 陽性的患者陰道微生態呈現更高的多樣性，乳桿菌數量顯著降低，多種厭氧菌屬過度增殖，進一步加重了陰道內菌群紊亂，兩者互為因果，形成惡性循環[14]。

本研究中陰道菌群正常存在炎癥反應組的HR-HPV 陽性率顯著低于陰道微生態正常組，與黃艷艷等[15]的研究結果一致。陰道細胞在某些致炎因素作用下，本身就可分泌細胞因子，在陰道局部免疫過程中發揮重要作用。IL-8 是一種由巨噬細胞和上皮細胞分泌的細胞因子，對中性粒細胞有細胞趨化作用，可實現對炎癥反應的調節；Th1 細胞可激活巨噬細胞和中性粒細胞，增強吞噬殺菌作用，發揮免疫保護功能；IL-17 作為Th17細胞的主要效應因子，能動員、募集及活化感染部位的中性粒細胞，從而有效介導組織的炎癥反應，促進抗菌肽β-防御素的釋放，維持黏膜細胞的完整性，防止感染[16]。因此可以推測白細胞的增多加強了陰道局部的免疫保護功能，從而抑制了HR-HPV 感染，其詳細機制有待深入觀察和研究。

陰道微生態異常還包括菌群抑制，是指待檢標本內細菌顯著減少，表現為無優勢菌，菌群密集度≤Ⅰ級，菌群多樣性≤Ⅰ級。本研究中菌群抑制組與陰道微生態正常組的HR-HPV 陽性率差異無統計學意義。吳文湘等[17]報道在無陰道不適癥狀的健康女性中仍有25%～ 40%存在異常菌群情況，說明菌群抑制未必增加HPV 的易感性，分析可能與復雜的陰道菌群中有相互拮抗的因素有關，有待于進一步研究。

陰道微生物受年齡、雌激素水平、飲食生活習慣、性生活方式等內外因素的影響，菌群的構成有所不同，而且各類菌群的生物學特性各異，使得它們在HPV 感染及宮頸病變的發生中會呈現不同的相關性。Ravel等[18]將不同種族育齡期女性未孕時的陰道菌群狀態分成5 種菌群類型(community state type，CST)，其中4 種以乳酸桿菌為主，包括CST Ⅰ(卷曲乳桿菌)、CST Ⅱ(加氏乳桿菌)、CST Ⅲ(惰性乳桿菌)和CST Ⅴ(詹氏乳桿菌)；另外CST Ⅳ以多種絕對或兼性厭氧菌占優勢，乳桿菌相對缺乏，主要包括加德納菌、普氏菌和巨型球菌等。研究發現卷曲乳桿菌ST1 珠對陰道上皮細胞有很強的蛋白依賴的黏附作用，它能競爭性抑制陰道加德納菌等的依附；還能夠產生大量過氧化氫，有利于維持低的陰道pH值，抑制致病微生物的生長[19]；能夠分解陰道細胞內的糖原，產生乳酸分子激活環磷酸腺苷，促進細胞的自噬作用，清除局部凋亡細胞、氧化應激碎片等，對陰道上皮細胞起到了保護作用[20]。惰性乳桿菌分泌的溶細胞素會使細胞黏膜形成孔洞而利于病毒的侵入，還會消耗大量的還原型谷胱甘肽，造成陰道氧化應激環境，促進HPV 的持續感染及子宮頸癌的發生發展[19]。CST-Ⅳ型菌群中的厭氧菌可代謝獲取的色氨酸生成吲哚類化合物，進而誘導免疫抑制，使病原體有效地避開宿主的防御機制導致長期感染[21]。CST-ⅣB型中阿托波菌數量多，可與加德納菌黏附于上皮細胞構成的胞外聚合物基質形成堅實的三維結構，并最終形成成熟的微生物生物膜，與加德納菌形成共生關系，促進其進一步發揮作用[22]。乳桿菌分泌的乳酸分為左旋和右旋兩種異構體，其中右旋乳酸對維持陰道穩態更有效。CST Ⅲ、CST Ⅳ中左旋乳酸比例較高，可通過上調基質金屬蛋白酶8 促進細胞外基質分解，破壞宮頸細胞的完整性，利于HPV 侵入基底角化細胞。CST Ⅰ、CST Ⅱ、CST Ⅴ中右旋乳酸含量較高，能分泌過氧化氫，刺激上皮細胞分泌抗微生物物質，宮頸陰道黏液的黏性較高，可限制病毒顆粒侵入，抑制組氨酸去乙酰化酶，激活陰道局部固有免疫分子的基因轉錄，從而達到激活免疫清除病原體的目的[23]。本研究中陰道微生態正常組與總的微生態異常組HR-HPV陽性率無統計學差異，推測是因為上述保護及致病因素相互制衡所致，所以在分析陰道微生態與HR-HPV 感染的相關性時要具體分析哪種指標的改變。

綜上所述，陰道微生態失衡與HR-HPV 感染之間的關系錯綜復雜，不能籠統地認為陰道微生態失衡會導致HPV 感染風險的增加，而要再細化到某些指標上來具體分析。健康穩定的微生態是維持宮頸及陰道健康的至關重要的因素，臨床上預防或清除HPV 感染的同時也需要關注陰道微生態的改變。

作者貢獻李莉：論文設計、構思、撰寫初稿；王銘洋、鄭文瑾：提供臨床咨詢和標本采集；馬瑩、付玉榮：實驗檢測和數據采集；于東渤：數據分析和研究；翟青枝：監督指導和稿件的審核修訂。

利益沖突本文作者聲明不存在潛在的利益沖突。

數據共享聲明本篇論文的關聯數據可依據合理理由從作者李莉處索取，Email：287112717@qq.com。