CXC 趨化因子受體1/2 在急性白血病中的異常表達及臨床意義探析

劉彥權(quán)，曾敏娟，殷悅，沈建箴，唐煥文

1 廣東醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院血液內(nèi)科，廣東東莞 523808；2 廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，廣東東莞 523808；3 福建省血液病研究所，福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院血液科，福建福州 350001

急性白血病(acute leukemia，AL)是一類高度異質(zhì)性、源自造血干祖細胞遺傳突變所致的惡性克隆性非實體腫瘤，AL 通常病情危重、預(yù)后差、治療難度大、復(fù)發(fā)率高，是一類難以治愈且嚴重威脅國人生命健康的惡性血液病[1-2]。CXC 趨化因子受體(CXC chemokine receptor，CXCR)及其配體之間的相互作用及其復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生影響，其中就包括了白血病細胞的激活、增殖和侵襲[3]。CXCR 家族由CXCR1～CXCR7 所組成，CXCR1 和CXCR2 是CXC 趨化因子配體白細胞介素8(CXC chemokine ligand 8，CXCL8)最具親和力且重要的受體，該“受體-配體”相互作用可誘導(dǎo)白細胞趨化性，進而引起細胞增殖和遷移，并與腫瘤惡性生物學(xué)行為調(diào)控機制密切相關(guān)[4]。目前已知，靶向CXCL8-CXCR1/2 軸在多種實體瘤中具有較大治療潛力[5-7]，但其在AL中的作用卻鮮為人知。本研究通過探索CXCR1/2在初診(new-diagnosed，ND) AL 患者中的表達情況，分析并探討AL 患者CXCR1/2 表達與臨床指標、預(yù)后的關(guān)系，旨在為AL 的基礎(chǔ)研究與治療靶點探尋提供較為新穎的方向，為改善AL 患者的生存質(zhì)量、遠期療效及長期預(yù)后提供新思路。

對象與方法

1 研究對象 收集2018 年11 月-2020 年12 月福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院血液科住院部、門診骨髓穿刺室共86 例初診AL 患者的臨床資料及骨髓血標本，其中男性49例，女性37例，年齡17～ 73歲，中位年齡48歲。所有患者均根據(jù)臨床表現(xiàn)、血常規(guī)檢查和骨髓MICM 國際分型診斷標準予以分型。同時收集26 例臨床診斷無血液病或其他惡性疾病的健康者骨髓血標本作為正常對照組，其中男性17例，女性9例，年齡23～49歲，中位年齡36.5歲。本研究經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(倫理編號：2019KY092)，入組本研究的患者均簽署知情同意書，臨床資料從病歷系統(tǒng)資料中獲取。入組研究的患者和對照者均在行骨髓穿刺術(shù)時留取3～ 5 mL骨髓液，并用肝素抗凝管抗凝。

2 主要儀器與試劑 超凈臺購于蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，微量移液器購于德國Eppendorf公司，熒光實時定量PCR 儀(7500型)購于美國ABI 公司，恒溫水浴箱購于英國Grant 公司，高速臺式離心機購于上海金鵬分析儀器有限公司，低溫高速離心機購于美國Thermo 公司，-20℃低溫冰箱購于中國美的公司，-80℃低溫冰箱、生物安全柜購于美國Thermo 公司；15 mL 離心管、10 mL移液管購于美國Thermo 公司，巴氏吸管購于NEST 公司，1.5 mL EP 管、PCR 管、八聯(lián)管均購于Axygen 公司；PBS 緩沖液購于Hyclone 公司，人淋巴細胞分離液購于廈門鷺隆生物公司，紅細胞裂解液購于北京索萊寶生物公司，TRIzol 試劑購于上海Invitrogen 公司，氯仿、異丙醇、無水乙醇均購于上海振興化工，焦碳酸二乙酯(DEPC)購于上海生工公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于南京諾唯贊公司，SYBR GreenMaster (ROX)購于北京康為世紀生物公司。

3 骨髓標本單個核細胞的提取 將骨髓血標本加入等體積淋巴細胞分離液至15 mL 離心管(骨髓液∶分離液＝1∶1)，等量PBS 稀釋骨髓標本，輕柔吹打混勻；將稀釋的骨髓緩慢疊加于人淋巴細胞分離液，形成分明的界限；室溫下2 000 r/min離心20 min，用移液管吸取上層血漿凍存以備后續(xù)ELISA 實驗，吸取中間云霧狀層單個核細胞層于1.5 mL EP 管中，PBS 洗滌兩遍后2 000 r/min 離心5 min，若存在較多紅細胞，則加入紅細胞裂解液2 mL，4℃裂解20 min，再用PBS 洗滌兩遍；吸棄上清，加入1 mL TRIzol 以備后續(xù)提取RNA，儲藏于-80℃。

4 骨髓單個核細胞總RNA 的提取 在骨髓標本處理后獲取的單個核細胞團加入1 mL TRIzol試劑混勻，冰上靜置10 min 后加入氯仿200 μL，充分震蕩混勻3 min，冰上靜置5 min 后于4℃下12 000 r/min 水平離心15 min，離心后吸取上層清液到另一預(yù)先對應(yīng)編號的EP 管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，碎冰上靜置10 min，靜置后于4℃下12 000 r/min 水平離心20 min，棄上清，加入無水乙醇1 mL，溫和震蕩離心管，輕彈管底，使沉淀懸浮，再于4℃下12 000 r/min 水平離心10 min，棄上清，加入適量DEPC 水(10～ 20 μL)，56℃水浴10 min，溶解RNA，吸取2 μL RNA于核酸蛋白定量儀中測定濃度和純度，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測CXCR1/2的表達水平 利用TRIzol RNA 提取試劑盒提取總RNA 并檢測濃度和純度后，按照南京諾唯贊逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用ABI 7500型熒光定量PCR 儀和SYBR GreenMaster (ROX)試劑盒進行PCR 擴增，以GAPDH 為內(nèi)參照，引物序列如下。CXCR1 引物序列：上游引物5’-TTCTCCATAGCTGCCTCAACC-3’，下游引物5’-TGTAGGAGGTAACACGATGACG-3’；CXCR2 引物序列：上游引物5’-TGGGCAACAATACAGCA AACT-3’，下游引物5’-GCACTTAGGCAGGAG GTCTTA-3’；GAPDH 引物序列：上游引物5’-CACCCACTCCTCCACCTTTGA-3’，下游引物5’-TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC-3’。總反應(yīng)體系20 μL：2 μL cDNA，10 μL SYBR Green (ROX)，上、下游引物各0.5 μL，RNase-free ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件如下，第一階段(預(yù)變性)：50℃ 2 min、95℃ 10 min，1 個循環(huán)；第二階段：95℃ 15 s (變性)、60℃ 1 min (退火/延伸)，共40 個循環(huán)；第三階段(溶解曲線分析)：95℃ 15 s、60℃ 1 min、95℃ 30 s、60℃ 15 s，1 個循環(huán)；采用Ct 值比較法予qRT-PCR 結(jié)果分析，并對比各CXCR 家族mRNA 表達水平，即ΔCt＝CtCXCR-CtGAPDH，采用2-ΔΔCT法計算各CXCR 的相對表達量，其中ΔΔCT＝(CTCXCR-CTGADPH)實驗組-(CTCXCR-CTGADPH)對照組。

6 研究指標 (1)比較初診AL 患者與健康者骨髓標本中的CXCR1/2 mRNA 表達水平；(2)以CXCR1/2 中位表達水平作為界值，將初診AL 患者分為CXCR1/2 高表達組和CXCR1/2 低表達組，分析不同CXCR1/2 表達水平與AL 患者臨床特征的關(guān)系；(3)分析57 例AML 患者CXCR1、CXCR2 表達與臨床特征及指標之間的關(guān)系。

7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料進行正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較用t檢驗(或校正t檢驗)；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以Md(IQR)表示，并進行非參數(shù)檢驗。等級資料采用秩和檢驗。分類計數(shù)資料采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 臨床AL 標本分型 如表1 所示，本研究納入的初診AL 患者86例，其中急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)組29 例(T型ALL 約1/4，B型ALL 約3/4)，急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)組57 例(M2 和M5型占AML 組的73.68%)。

表1 臨床AL 標本分型統(tǒng)計(例，%)Tab.1 Classification and statistics of clinical AL specimens (n,%)

2 CXCR1/2 在初診AL 組與健康對照組中的表達比較 以本研究樣本CXCR1/2 水平數(shù)據(jù)繪制數(shù)據(jù)圖(圖1)。其中左兩數(shù)據(jù)簇分別為健康對照組(26 例)和初診AL 組(86 例)。右兩數(shù)據(jù)簇則為初診AL 組的兩分型組，分別為AML 組(57 例)和ALL 組(29 例)。

圖1 CXCR1、CXCR2 在初診AL 組(含分組)與健康對照組中的表達比較Fig.1 Differences in the relative expression of CXCR1 and CXCR2 in newly diagnosed AL groups and healthy control group

如圖1 所示，CXCR1 在初診AL 組中的中位相對表達量為0.691(0.176～ 2.14)，在健康對照組中的中位相對表達量為0.278(0.088～ 0.613)；而CXCR2 在初診AL 組中的中位相對表達量為1.938(0.729～ 3.681)，在健康對照組中的中位相對表達量為0.419(0.079～ 1.268)，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。此外，CXCR1、CXCR2 在AML組中的中位相對表達水平分別為0.704、1.965，AML 組與ALL 組的CXCR1/2 表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

3 初診AL 患者CXCR1/2 表達與臨床特征的關(guān)系 CXCR1 高表達組(ExpressionCXCR1≥0.691)的白細胞(white blood cell，WBC)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、C 反應(yīng)蛋白(Creactive protein，CRP)等炎癥指標均顯著高于低表達組(ExpressionCXCR1＜0.691)(P＜0.05)，且CXCR1表達與患者初次就診時是否發(fā)熱、皮膚蒼白、血紅蛋白(hemoglobin，Hb)、血小板(platelet，PLT)、骨髓及外周血原始細胞數(shù)等臨床特征與指標有關(guān)(P＜0.05)，與患者的年齡、性別、疲勞程度、髓外浸潤情況等無關(guān)(P＞0.05)。見表2。

表2 AL 患者CXCR1、CXCR2 表達與臨床特征的關(guān)系Tab.2 Relationship between CXCR1/2 expression and clinical characteristics in AL patients

CXCR2 高表達組(ExpressionCXCR2≥1.938)患者WBC、LDH、CRP 炎癥指標以及骨髓原始細胞數(shù)、外周血原始細胞數(shù)均顯著高于低表達組(ExpressionCXCR2＜1.938)(P＜0.05)、Hb、PLT 顯著低于低表達組(P＜0.05)。此外，CXCR2 的表達與發(fā)熱、疲勞、皮膚蒼白等臨床特征密切關(guān)聯(lián)(P＜0.05)，CXCR2 高表達患者相比低表達患者更易出現(xiàn)髓外浸潤(P＜0.05)。CXCR2 的表達與患者的性別、PCT、淋巴結(jié)腫大等無關(guān)(P＞0.05)。

4 初診AL 樣本中AML 患者CXCR1/2 表達與臨床指標的關(guān)系 CXCR1 高表達組(ExpressionCXCR1≥0.704)中M2 和M5 患者居多，占全部AML 分型的80%以上，且CXCR1 的表達與患者貧血程度、WBC、PLT、骨髓原始細胞數(shù)目密切相關(guān)(P＜0.05)，與性別、年齡、FAB 分型、髓外浸潤情況、細胞遺傳學(xué)危險分組及分子遺傳學(xué)特征無關(guān)(P＞0.05)。見表3。

表3 AML 患者CXCR1、CXCR2 表達與臨床指標的關(guān)系Tab.3 Relationship between the expression of CXCR1,CXCR2 and clinical indicators in the AML patients

CXCR2 高表達組(ExpressionCXCR2≥1.965)中M2 和M5 亦占全部AML 分型的80%以上，其他分型在高表達組與低表達組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，CXCR2 的表達與患者性別、髓外浸潤情況、細胞遺傳學(xué)危險分層和分子生物學(xué)特征無關(guān)(P＞0.05)，但CXCR2 高表達患者較低表達患者更易出現(xiàn)較差的實驗室檢查結(jié)果(P＜0.05)。

討論

AL 是一類源自淋巴造血系統(tǒng)且高度異質(zhì)性的非實體性惡性腫瘤，盡管標準誘導(dǎo)化療聯(lián)合靶向藥物、免疫治療、骨髓移植等手段可使部分AL 患者改善病情、延長生命，但AL 臨床療效及預(yù)后不容樂觀，病死率仍居高不下[8-9]。根據(jù)世衛(wèi)組織國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)和中國國家癌癥中心(NCC)的最新數(shù)據(jù)，2020 年中國新發(fā)癌癥人數(shù)、癌癥死亡人數(shù)均位居全球第1，其中白血病死亡人數(shù)位居全球所有癌癥第10 位；在我國，白血病位居男性癌癥發(fā)病率的第7位，分別是我國城市地區(qū)癌癥高發(fā)及癌癥病死率的第5 位、第4 位惡性腫瘤，且白血病位居我國所有癌癥死亡總數(shù)中的第9位，是目前嚴重威脅國人生命健康且難以治愈的惡性疾病[10-11]。為此，積極尋找AL 新治療靶點，尋求對AL 診斷、治療及預(yù)后評估有價值的分子標志物尤為重要。

趨化因子是一類由基質(zhì)細胞或腫瘤細胞所產(chǎn)生的可移動趨化的小分子分泌型蛋白，根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)，學(xué)術(shù)界將趨化因子分為CXC、CC、CX3C及C 四大類別，而趨化因子受體作為G 蛋白偶聯(lián)受體超家族的關(guān)鍵成員，基于趨化因子配體可將其分為CXCR、CCR、CX3CR 和CR 這四類[12-14]。趨化因子與其受體相結(jié)合后通過激活相關(guān)信號通路等在內(nèi)的生物學(xué)機制調(diào)控腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移或影響機體免疫反應(yīng)從而介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。CXCR1/2 作為G 蛋白偶聯(lián)受體超家族的關(guān)鍵成員，其亦是CXC 趨化因子配體8(CXCL8)極具親和力的受體，CXCR1 與CXCR2 彼此具有76%的同源性序列，CXCL8 通過與CXCR1/2 結(jié)合共同組成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在機體免疫、腫瘤微環(huán)境等方面扮演著不可或缺的角色[15-16]。既往研究證實，CXCR1/2 在多種惡性腫瘤中異常表達，并在促進腫瘤化療耐藥、轉(zhuǎn)移以及維持腫瘤干細胞特性等方面尤為關(guān)鍵[17-18]。但目前對于CXCR1/2 在血液系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展中是否存在一定的調(diào)控關(guān)系或作用機制等相關(guān)研究甚少，其很有可能成為白血病臨床診療的新型標志物。

本研究采用qRT-PCR 技術(shù)檢測86 例ND-AL患者及26 例健康對照者骨髓血標本中CXCR1/2的表達情況，結(jié)果表明CXCR1/2 在AL 患者中表達上調(diào)，利用CXCR1/2 相對表達量中位數(shù)法(Expressionmedian)將所有病例標本分為CXCR1/2 高表達組和CXCR1/2 低表達組，結(jié)果顯示CXCR1 高表達組WBC、LDH、CRP 以及某些炎癥指標均顯著高于低表達組，且CXCR1 的表達與患者初次就診時是否發(fā)熱、皮膚蒼白、WBC、Hb、PLT、LDH、CRP、骨髓及外周血原始細胞數(shù)等臨床特征與指標有關(guān)，與患者的年齡、性別、疲勞程度、髓外浸潤情況等無關(guān)。而CXCR2 的表達與發(fā)熱、疲勞、皮膚蒼白等臨床特征相關(guān)，且CXCR2 高表達組WBC、LDH、CRP 炎癥指標以及骨髓原始細胞數(shù)、外周血原始細胞數(shù)均顯著高于低表達組，而Hb、PLT 顯著低于低表達組，此外CXCR2 高表達患者相比CXCR2 低表達患者更易出現(xiàn)髓外浸潤，CXCR2 的表達與患者的性別、PCT 以及淋巴結(jié)腫大等無關(guān)。上述結(jié)果提示，CXCR1/2 高表達與臨床不良癥狀、體征以及較差的實驗室結(jié)果密切相關(guān)，間接提示CXCR1/2 可能參與了AL 的發(fā)生發(fā)展致病機制，且很有可能與AL 患者的病情發(fā)展、療效欠佳及預(yù)后不良等密切相關(guān)。

由于AML 是成年人最常見的白血病類型，為了更細致地探索CXCR1/2 在白血病中的異常表達與臨床特征的關(guān)聯(lián)，本研究后續(xù)將納入本研究所有臨床樣本中診斷為AML 的57 例患者數(shù)據(jù)單獨進行研究，探討AML 患者CXCR1/2 表達情況與各臨床指標及特征的關(guān)聯(lián)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CXCR1/2 表達在FAB 分型中存在一定關(guān)聯(lián)和特點，在CXCR1、CXCR2 高表達組中均以M2 和M5 患者居多，分別占全部AML(FAB)分型的81.81%、85.72%。此外，CXCR1/2 高表達患者貧血、出血、感染及髓外浸潤等風(fēng)險與低表達患者相比更為嚴重，表明CXCR1/2 與不良臨床指標關(guān)系緊密相關(guān)，CXCR1/2很有可能作為ND-AL 患者，尤其是AML 患者療效及預(yù)后的重要評估指標。值得關(guān)注的是，Tang等[19]亦采用qRT-PCR 技術(shù)檢測ND-AML 患者體內(nèi)CXCR2 表達情況，發(fā)現(xiàn)AML 患者CXCR2 高表達預(yù)示著長期生存率低，是預(yù)后不良的獨立危險因素，且CXCR2 高表達提示易發(fā)生白血病髓外浸潤，本研究與該研究結(jié)論基本一致。

本研究的創(chuàng)新之處是將基礎(chǔ)研究緊密聯(lián)系臨床，并將基礎(chǔ)研究成果轉(zhuǎn)化付諸于臨床實踐。但由于本研究為單中心樣本且存在納入例數(shù)少、隨訪時間短等不足，今后本課題組將更為深入地開展CXCR1/2 在AL 中的致病機制研究，進一步揭示CXCR1/2 在白血病發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用。總之，本研究證實CXCR1/2 在AL 患者中表達上調(diào)，可作為AL 患者診療中的重要分子標志物和生物學(xué)靶點，檢測CXCR1/2 mRNA 表達水平，對評估AL 患者的臨床療效、預(yù)后價值等方面具有極為重要的指導(dǎo)意義，依據(jù)CXCR1/2 表達水平可對AL 患者進行個體化、精準性的分組治療，繼而最大程度改善患者預(yù)后。此外，本研究結(jié)果亦在一定層面上提示CXCR1/2 在AL 致病機制中起到關(guān)鍵作用，未來很可能是抗白血病基礎(chǔ)研究與臨床的重要突破口，并為抗白血病治療及研究提供重要的理論基礎(chǔ)和現(xiàn)實依據(jù)。

作者貢獻劉彥權(quán)：研究設(shè)計、實驗研究實施與監(jiān)督、文獻查閱與論據(jù)完善、撰寫或修改論文；殷悅：實驗技術(shù)支持、實驗研究實施與監(jiān)督；曾敏娟：數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析與核查校對；沈建箴、唐煥文：研究指導(dǎo)與總體把關(guān)、經(jīng)費與行政支持。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

數(shù)據(jù)共享聲明本研究相關(guān)數(shù)據(jù)暫不共享。