NE對(duì)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元外周傳入突觸傳遞及其表觀受體動(dòng)力學(xué)的影響

張 闖,汪萌芽

(皖南醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞電生理研究室,安徽 蕪湖 241002)

去甲腎上腺素(Norepinephrine,NE)在運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)中具有重要的作用[1],Tartas等首次證明新生大鼠腰部脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(Motoneuron,MN)上表達(dá)α1、α2、β三種腎上腺素能受體[2]。目前,NE通過降低鉀電導(dǎo)引起脊髓MN去極化的作用已較為明確[2];然而,在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中的MN不僅接受神經(jīng)調(diào)質(zhì)的直接作用,其突觸輸入也是調(diào)節(jié)脊髓MN興奮性的一個(gè)重要部分。其中,Abramets等運(yùn)用腹根場(chǎng)電位記錄技術(shù)發(fā)現(xiàn)NE可增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的放電[3]。由于實(shí)驗(yàn)方法的緣故,早期的研究還不能詳細(xì)分析NE在MN突觸傳遞上的作用。因此,本研究采用脊髓切片MN細(xì)胞內(nèi)記錄技術(shù),用電刺激同側(cè)背根(ipsilateral dorsal root,iDR)作為感覺傳入纖維的激活[4],探討NE對(duì)脊髓MN的外周傳入性突觸傳遞的影響并分析EPSP的受體動(dòng)力學(xué)機(jī)制,為脊髓運(yùn)動(dòng)控制機(jī)制的研究提供新的認(rèn)識(shí)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 8～14日齡新生Sprague-Dawley(SD)大鼠,雌雄不拘,購買自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司,許可證號(hào)SCXK(魯)2019-0003;DL-去甲腎上腺素鹽酸鹽購自上海麥克林生化科技有限公司,產(chǎn)品批號(hào):C10982431;藥品用蒸餾水配成母液后置于低溫避光保存,臨用前用人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)稀釋到所需濃度灌流。ACSF配方:CaCl22.4 mmol/L,NaCl 127.0 mmol/L,MgSO4·7H2O 1.3 mmol/L,Glucose·H2O 10.0 mmol/L,NaHCO326.0 mmol/L,KH2PO41.2 mmol/L,KCl 1.9 mmol/L。

1.2 脊髓切片制備 根據(jù)已報(bào)道的方法[5],取SD新生大鼠經(jīng)乙醚麻醉后,分離出腰骶膨大處脊髓段,用振蕩切片機(jī)(Vibratome 1500)制備400～500 μm脊髓橫切片3～6片,室溫下(25±2)℃置于含95%O2和5%CO2混合氣體飽和的ACSF中備用。

1.3 電生理記錄 將脊髓切片快速移入全浸式記錄浴槽,采用上、下絲網(wǎng)相夾的方式固定切片,經(jīng)恒流泵持續(xù)向浴槽內(nèi)持續(xù)灌流用混合氣體飽和的ACSF。取內(nèi)充3 mol/L乙酸鉀、尖端阻抗為60～120 MΩ的微電極借助微操縱儀(MP-1,Narishige,Japan)在顯微鏡下對(duì)脊髓腹角進(jìn)行細(xì)胞穿刺,記錄的電信號(hào)通過微電極放大器(Axoclamp 9000A,Axon Instruments,USA)放大后,經(jīng)DigiData 1440A轉(zhuǎn)換接口(Axon)輸入計(jì)算機(jī),用Clampex 10.2軟件(Axon)進(jìn)行采樣、記錄和貯存。細(xì)胞內(nèi)電流刺激經(jīng)微電極注入細(xì)胞內(nèi),同側(cè)背根(iDR)和同側(cè)腹根(ipsilateral ventral root,iVR)電刺激由三通道電刺激器(Nihon Kohden,Japan)輸出,經(jīng)隔離器(Nihon Kohden,Japan)以恒壓模式至同芯雙極刺激電極(Frederick Haer & Co．,USA)。利用置于iVR的刺激電極,對(duì)靜息電位(resting potential,RP)負(fù)于-60 mV且動(dòng)作電位(action potential,AP)有超射的穩(wěn)定細(xì)胞進(jìn)行逆行激活鑒定,若記錄到具有“全或無”特點(diǎn)的逆行AP,即可鑒定為MN,并用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)記錄與分析 實(shí)驗(yàn)記錄到的數(shù)據(jù)用Clampex 10.2(Axon)保存,再用Clampfit 10.2軟件(Axon)進(jìn)行細(xì)胞電生理參數(shù)分析,其中上升時(shí)間(rise time)是上升相10%～90%的時(shí)間,衰減時(shí)間(decay time)是下降相90%～10%的時(shí)間。另用表觀受體動(dòng)力學(xué)分析方法對(duì)EPSP進(jìn)行分析[6],其K1為表觀結(jié)合速率常數(shù);K2為表觀解離速率常數(shù);KT為表觀平衡解離常數(shù);Vmax為表觀最大反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 NE對(duì)脊髓MN電學(xué)性質(zhì)的影響 在7個(gè)穩(wěn)定記錄的MN,1、5、25 μmol/L的NE各累積灌流15 min,均濃度依賴性誘導(dǎo)了伴有膜電阻增大的去極化反應(yīng)(P<0.01),并降低誘發(fā)AP的基強(qiáng)度(P<0.01)、AP的幅度(P<0.01)、閾電位(P<0.05)、超射值(P<0.05)、鋒電位幅度(P<0.01)和最大上升速率(P<0.05),見表1。

表1 NE對(duì)脊髓MN基本電生理參數(shù)的影響

2.2 NE對(duì)脊髓MN動(dòng)作電位發(fā)放頻率的影響 在7個(gè)穩(wěn)定記錄的MN,1、5、25 μmol/L的NE各累積灌流15 min,細(xì)胞不但呈現(xiàn)濃度依賴性去極化作用伴隨AP和鋒電位幅度的減小,而且升高了AP發(fā)放頻率;手動(dòng)鉗制膜電位至RP水平后,AP和鋒電位的幅度可增加,但仍可觀察到NE濃度依賴性增加脊髓MN鋒電位發(fā)放頻率,ACSF沖洗后,興奮作用可被洗出,見圖1。

對(duì)照:用藥前;RP:靜息電位;鉗制:手動(dòng)鉗制膜電位至RP水平,左側(cè)數(shù)字表示NE的濃度;右側(cè)數(shù)字表示膜電位的變化;沖洗:ACSF沖洗40 min。

對(duì)記錄的7個(gè)MN給予不同強(qiáng)度(0.4～0.8 nA,100 ms)的細(xì)胞內(nèi)去極化脈沖,脊髓MN的放電頻率與電流強(qiáng)度相關(guān)性升高(I-F關(guān)系曲線),對(duì)7個(gè)穩(wěn)定記錄的MN累積灌流1、5、25 μmol/L的NE各15 min,觀察到脊髓MN的I-F關(guān)系曲線上移,NE濃度依賴性升高M(jìn)N的動(dòng)作電位發(fā)放頻率(P<0.01),見圖2。

2.3 NE對(duì)脊髓MN iDR-EPSP的影響 電刺激(0.1～0.2 ms,0.1 Hz,10～100V)脊髓iDR在7個(gè)MN誘發(fā)出iDR-EPSP,待記錄穩(wěn)定后,累積灌流1、5、25 μmol/L的NE各15 min,可濃度依賴性降低iDR-EPSP的幅度(P<0.01)、曲線下面積(P<0.01)、時(shí)程(P<0.01)、衰減時(shí)間(P<0.05),ACSF沖洗后可恢復(fù);其典型記錄見圖3,電生理參數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

表2 NE對(duì)離體脊髓MN iDR-EPSP電生理參數(shù)的影響

2.4 NE影響脊髓MN iDR-EPSP表觀受體動(dòng)力學(xué)的分析 對(duì)12個(gè)誘導(dǎo)出iDR-EPSP后可穩(wěn)定記錄的MN,灌流5 μmol/L NE可抑制iDR-EPSP,分析用藥前后的表觀受體動(dòng)力學(xué)的變化,見圖4A;在12個(gè)測(cè)試細(xì)胞中的10個(gè),iDR-EPSPs的表觀受體動(dòng)力學(xué)分析顯示,NE降低表觀最大反應(yīng)(Vmax)從(4.20±1.41)mV至(2.55±1.34)mV(P<0.01),降低表觀結(jié)合速率常數(shù)(K1)從(0.694±0.540)T-1·ms-1至(0.408±0.309)T-1·ms-1(P<0.05),而顯示增高表觀解離速率常數(shù)(K2)從(0.042±0.022)ms-1至(0.046±0.022)ms-1的趨勢(shì)(P>0.05),增加表觀平衡解離常數(shù)(KT)從(0.146±0.211)T至(0.248±0.297)T(P<0.05),見圖4B;另外2個(gè)MNs iDR-EPSPs的表觀受體動(dòng)力學(xué)分析顯示,表觀平衡解離常數(shù)(KT)和表觀解離速率常數(shù)(K2)均減小。

3 討論

腎上腺素能受體(adrenergic receptor,AR)均為G蛋白耦聯(lián)受體,根據(jù)受體亞型激活不同的下游信號(hào)介導(dǎo)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,可分為三類:α1受體(α1A、α1B、α1C)、α2受體(α2A、α2B、α2C)和β腎上腺素受體(β1、β2、β3)[7]。α1-AR激活Gq途徑,促進(jìn)磷脂酶C(phospholipase C,PLC)、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)和Ca2+釋放,并降低K+電導(dǎo);而α2-AR與Gi蛋白耦聯(lián),抑制環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine,cAMP)的產(chǎn)生,可增加K+電導(dǎo)并抑制Ca2+通道[8-10]。β-AR通過Gs途徑激活腺苷酸環(huán)化酶,激活β-AR可降低K+電導(dǎo),增加cAMP,增強(qiáng)Ca2+電流[11-12]。

近期的研究表明NE在MN上的作用是興奮的,可降低鉀電導(dǎo)并引起去極化反應(yīng)[2,13-14],另有研究表明,早期的超極化作用可能是由于方法學(xué)上的差異造成的[15]。實(shí)驗(yàn)中觀察到NE濃度依賴性誘導(dǎo)去極化反應(yīng)并伴隨膜電阻增大等現(xiàn)象與文獻(xiàn)的報(bào)道一致[2]。在累積灌流不同濃度NE的MN中,AP和鋒電位的幅度均濃度依賴性減小,但手動(dòng)鉗制膜電位至RP水平,其AP和鋒電位的幅度可明顯增加。該結(jié)果說明脊髓MN的AP的幅度和鋒電位的幅度降低與其去極化反應(yīng)有關(guān)。另外,NE濃度依賴性增強(qiáng)脊髓MN鋒電位的放電頻率,其MN的I-F關(guān)系濃度依賴性上移,這與報(bào)道的NE可增加MN的放電頻率的結(jié)果一致[2]。KIR通道對(duì)膜電位和神經(jīng)元興奮性具有重要的作用,也是許多G蛋白耦聯(lián)受體的主要靶標(biāo)[16],在新生大鼠脊髓中,NE通過抑制KIR電流而增加MN的興奮性[2]。

研究發(fā)現(xiàn),NE既可濃度依賴性增強(qiáng)脊髓MN的自身活動(dòng),又可濃度依賴性抑制iDR-EPSP,且NE對(duì)突觸傳遞的抑制作用與MN膜電阻增大、放電頻率增加等電生理特性背道而馳。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室提出的突觸反應(yīng)的表觀受體動(dòng)力學(xué)分析方法[6],可探討遞質(zhì)與受體結(jié)合、解離的速率和受體的親和力等受體動(dòng)力學(xué)性質(zhì),為抑制的機(jī)制研究提供思路。iDR-EPSP的表觀受體動(dòng)力學(xué)分析表明,表觀最大反應(yīng)Vmax和表觀結(jié)合速率常數(shù)K1減小,而表觀平衡解離常數(shù)KT增大和表觀解離速率常數(shù)K2有增大趨勢(shì);該結(jié)果提示,NE作用后,突觸后表觀受體動(dòng)力學(xué)過程發(fā)生改變、遞質(zhì)與受體結(jié)合速率減小和突觸后受體親和力降低;另外,表觀最大反應(yīng)Vmax減小可能反映了能產(chǎn)生效應(yīng)的受體總量的減少。因此,NE抑制外周傳入的興奮性突觸傳遞可能涉及突觸后受體動(dòng)力學(xué)改變或突觸后谷氨酸受體親和力降低的機(jī)制。

另有研究表明,NE通過激活突觸前的α1和β腎上腺素能受體可增加脊髓腹角神經(jīng)元自發(fā)性EPSCs的頻率和幅度[8],并增強(qiáng)脊髓T13-L2網(wǎng)絡(luò)向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的谷氨酸能突觸輸入[2]。而在小鼠內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元中,NE通過激活α2-AR減少谷氨酸能傳遞[9];在大腦皮層中,激活α1-AR可抑制谷氨酸受體介導(dǎo)的興奮性傳遞[17-18]。與α-AR的復(fù)雜作用不同的是,β-AR可在促進(jìn)LTP的誘導(dǎo)和維持中發(fā)揮重要的作用[19]。此外,Liu等發(fā)現(xiàn),α2A-ARs通過負(fù)向調(diào)節(jié)AC/cAMP/PKA通路并抑制NMDA受體功能,β-AR通過正向調(diào)節(jié)cAMP/PKA途徑增強(qiáng)NMDA受體功能,α1A-ARs可激活PLC/IP3/Ca2+通路而抑制NMDA受體的功能[20]。因此,一種較為可能的機(jī)制是,NE既可通過G蛋白耦聯(lián)受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響K+通道來改變MN的興奮性,又可通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響谷氨酸受體等的功能,從而抑制外周傳入的興奮性突觸傳遞。

A.NE濃度依賴性增加脊髓MN AP發(fā)放頻率的典型實(shí)驗(yàn)記錄,RP為-63 mV;對(duì)照:用藥前;左側(cè)數(shù)字表示NE的濃度;右側(cè)數(shù)字表示細(xì)胞內(nèi)去極化電流強(qiáng)度;沖洗:ACSF沖洗45 min。B.NE對(duì)離體脊髓MN I-F關(guān)系曲線的影響重復(fù)測(cè)量雙因素方差分析:FNE濃度=54.083,##P<0.01;F電流=5.010,**P<0.01;FNE濃度×電流=0.165,P>0.05。

對(duì)照:用藥前,左側(cè)數(shù)字表示NE的濃度,累積灌流1、5和25 μmol/L NE各15 min,沖洗:ACSF沖洗45 min,RP為-63 mV;圖中每一記錄為10次采樣的平均曲線,箭頭所指為iDR電刺激偽跡。

A.NE對(duì)脊髓MN iDR-EPSP的影響;對(duì)照:用藥前;沖洗:ACSF沖洗30 min;RP為-65 mV;B.a、b、c、d分別表示NE對(duì)iDR-EPSP表觀受體動(dòng)力學(xué)參數(shù)K1、K2、KT和Vmax的影響。

綜上所述,NE抑制iDR-EPSP可能與改變突觸后受體動(dòng)力學(xué)過程并主要降低谷氨酸受體的親和力有關(guān),但仍需進(jìn)一步驗(yàn)證;另外,NE的作用可能是突觸前和突觸后多種受體的綜合效應(yīng),NE是否還存在其他更為復(fù)雜的機(jī)制,有待進(jìn)一步的探索。