傳染性單核細胞增多癥患兒外周血T淋巴細胞亞群變化及其臨床意義

李慧，劉晶，楊金英

1.西北婦女兒童醫院兒童血液腫瘤科，陜西 西安 710003；

2.寶雞市婦幼保健院兒童感染科，陜西 寶雞 721000；

3.西安市人民醫院(西安市第四醫院)新生兒科，陜西 西安 710000

傳染性單核細胞增多癥(infectious mononucleosis，IM)是一種由EB 病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染所致的急性傳染性疾病，頸部淋巴結腫大、發熱以及咽喉疼痛為IM 疾病典型臨床表現。此外，患者還伴有外周血異型淋巴細胞水平上升以及肝臟脾臟腫大等相關表現[1-2]。IM好發于兒童群體，患兒感染后癥狀隱秘，未見明顯臨床表現，診斷存在難度，雖然IM為自限性疾病，大部分患兒預后良好，但是依然有少量患兒會出現嗜血細胞增多癥等嚴重并發癥，預后情況不佳[3]。目前尚未完全明確IM發病具體機制，但是已經了解到其發生與機體免疫功能紊亂關系密切[4-5]。因此探究IM 發生及病情進展與免疫功能之間關系不僅有利于分析IM 具體發病機制，還對患兒其后病情診斷以及治療具有積極意義。本研究分析IM 患兒外周血T淋巴細胞亞群水平變化及其在患兒病情發生進展中作用，以深入了解IM 免疫功能異常狀態，為后期患兒病情評估及治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018—2020 年寶雞市婦幼保健院收治的105例IM患兒作為研究組。納入標準：(1)IM 參照對應標準[6]確診；(2)患者病情由臨床表現、血清學病毒抗體以及外周血涂片實驗等證實；(3)入組前尚未行任何對癥治療；(4)年齡1～13歲。排除標準：(1)存在重要器官如消化道、心臟、肝臟等功能異常者；(2)入組前應用免疫抑制劑或者糖皮質激素治療者；(3)存在其他感染或者并發惡性腫瘤者；(4)并發先天性免疫異常疾病或者免疫功能障礙者。選取同期在醫院體檢的健康兒童100 例作為對照組。對照組兒童各項相關檢查均正常，無其他疾病。研究組中男性56 例，女性49 例；年齡1～13 歲，平均(6.24±1.53)歲。對照組中男性51 例，女性49 例；年齡1～13 歲，平均(6.58±1.76)歲。兩組兒童的性別和年齡比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究經醫院醫學倫理會批準，所有兒童監護人均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血T淋巴細胞亞群測定 外周血T淋巴細胞亞群應用流式細胞術進行測定，測定相應試劑以及抗體均采購自美國BD公司。研究組患兒在治療前，對照組在體檢當日收集空腹靜脈血2 mL保存于肝素抗凝管中，加入等量磷酸緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)后進行外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)分離。將分離獲得的50 μL PBMC加入10 μL CD3-PE-Cy5、10 μL CD4-PE、10 μL CD8-FITC，以渦旋方式混勻后在室溫環境下進行15 min避光孵育，孵育結束后進行離心洗滌，將上清液棄去后加入300 μL PBS，12 h 內上機測定。其他分離獲得PBMC中加入佛波酯、離子霉素以及莫能霉素，置于37℃及5%CO2環境中培養4～6 h，隨后再次進行離心洗滌，收集100 μL 刺激培養細胞添加IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PE-Cy5 各20 μL 作為同型對照，渦旋混勻后在室溫環境下進行15 min 避光孵育。另收集100 μL刺激培養細胞添加20 μL CD3-PE-Cy5與20 μL CD8-FITC 為待測樣品管，渦旋混勻后避光孵育以進行細胞膜表面標記，離心、洗滌、重懸后加入100 μL固定劑進行15 min 室溫避光孵育，離心、洗滌、棄去上清液后緩慢混勻，加入100 μm破膜劑，室溫環境下避光孵育5 min后離心洗滌。待測樣品管細胞均分為兩管，分別向其中加入10 μL白介素-4-PE與干擾素-γ-PE，渦旋均勻后避光孵育處理15 min以使細胞內細胞因子染色，離心洗滌后將上清液棄去，隨后在試管內加入PBS 300 μL 進行細胞重懸，上機測定CD8+、CD4+、CD3+水平，并計算CD4+/CD8+值。

1.2.2 患兒病程及病情嚴重程度評估 入院后依據病程將患兒分為急性期組與恢復期組，其中急性期為首次發病7 d 時間內，恢復期為初次發病至接受治療后25～30 d[7]。依據IM所致系統損傷將患者分為輕癥組與重癥組，其中輕癥為IM發生伴最多1個系統損傷，重癥為IM發生伴最少兩個系統損傷[8]。

1.3 統計學方法 應用SPSS20.0軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，計數資料表示為例，差異比較采用χ2檢驗，應用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析T 淋巴細胞亞群對IM 的診斷價值，應用Spearman 相關性分析外周血T 淋巴細胞亞群與病程、病情嚴重程度之間的相關性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組兒童的外周血T淋巴細胞亞群比較 研究組兒童的CD8+、CD3+明顯高于對照組，CD4+、CD4+/CD8+明顯低于對照組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 兩組兒童的外周血T淋巴細胞亞群比較(±s)Table 1 Comparison of peripheral blood T lymphocyte subsets between the two groups of children(±s)

表1 兩組兒童的外周血T淋巴細胞亞群比較(±s)Table 1 Comparison of peripheral blood T lymphocyte subsets between the two groups of children(±s)

組別研究組對照組t值P值例數105 100 CD8+(%)40.33±7.26 21.59±6.28 19.724 0.001 CD4+(%)20.53±5.19 35.94±6.57 18.682 0.001 CD3+(%)78.29±7.54 62.94±8.14 14.015 0.001 CD4+/CD8+0.63±0.19 1.34±0.43 15.414 0.001

2.2 T 淋巴細胞亞群對IM的診斷價值 經ROC分析結果顯示，CD8+、CD4+、CD3+、CD4+/CD8+用于IM診斷的曲線下面積(AUC)分別為0.850、0.848、0.810、0.771，見表2和圖1。

圖1 T淋巴細胞亞群對IM診斷價值的ROC曲線分析Figure 1 ROC curve analysis of the diagnostic value of T lymphocyte subsets in IM

表2 T淋巴細胞亞群對IM的診斷價值Table 2 Diagnostic value of T lymphocyte subsets in IM

2.3 不同病程患兒的T 淋巴細胞亞群水平比較 依據病程進行分組，105 例患兒中急性期與恢復期分別68 例與37 例，急性期組兒童的CD8+、CD3+明顯高于恢復期組，CD4+、CD4+/CD8+明顯低于恢復期組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

表3 不同病程患兒的T淋巴細胞亞群水平比較±s)Table 3 Comparison of T lymphocyte subsets between children with different courses of disease(±s)

表3 不同病程患兒的T淋巴細胞亞群水平比較±s)Table 3 Comparison of T lymphocyte subsets between children with different courses of disease(±s)

組別急性期組恢復期組t值P值例數68 37 CD8+(%)44.23±5.79 33.16±2.89 10.896 0.001 CD4+(%)18.19±3.22 24.83±5.40 7.898 0.001 CD3+(%)80.55±7.22 74.14±6.31 4.539 0.001 CD4+/CD8+0.59±0.17 0.70±0.20 3.038 0.003

2.4 不同病情嚴重程度患兒的T 淋巴細胞亞群水平比較 依據患兒病情嚴重程度進行分組，105 例患兒中輕癥與重癥患兒分別43 例與62 例，重癥組兒童的CD8+、CD3+明顯高于輕癥組，CD4+、CD4+/CD8+明顯低于輕癥組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表4。

表4 不同病情嚴重程度患兒的T淋巴細胞亞群水平比較(±s)Table 4 Comparison of T lymphocyte subsets between children with different disease severity(±s)

表4 不同病情嚴重程度患兒的T淋巴細胞亞群水平比較(±s)Table 4 Comparison of T lymphocyte subsets between children with different disease severity(±s)

組別輕癥組重癥組t值P值例數43 62 CD8+(%)33.94±5.29 44.76±4.67 11.050 0.001 CD4+(%)23.96±5.14 18.15±3.70 6.736 0.001 CD3+(%)74.22±3.64 81.11±8.25 5.132 0.001 CD4+/CD8+0.73±0.18 0.56±0.17 4.979 0.001

2.5 外周血T淋巴細胞亞群與病程、病情嚴重程度的相關性 經Spearman相關性分析結果顯示，外周血CD8+、CD3+水平與病程呈負相關(P＜0.05)，CD4+、CD4+/CD8+水平與病程呈正相關(P＜0.05)；外周血CD8+、CD3+水平與病情嚴重程度呈正相關(P＜0.05)，CD4+、CD4+/CD8+水平與病情嚴重程度呈負相關(P＜0.05)，見表5。

表5 外周血T淋巴細胞亞群與病程、病情嚴重程度的相關性Table 5 Correlation analysis between peripheral blood T lymphocyte subsets and course of disease and disease severity

3 討論

IM為EBV侵入導致全身免疫功能損傷傳染類疾病，B淋巴細胞表面存在EBV受體，EBV在人體與對應受體結合后可以促進含有核抗原B淋巴細胞增殖，誘使淋巴細胞出現異型，促進T淋巴細胞免疫應答以及增殖過程，最終導致IM發生以及患者病情進展[9-10]。研究顯示IM 發生為繼發惡性組織細胞增生癥以及淋巴細胞白血病重要危險因素，其也是兒童惡性腫瘤發生重要原因之一，IM患兒免疫功能缺乏以及不足是患者預后不佳重要原因之一，因此及時評估IM 患兒免疫功能是避免病情進一步惡化，改善患兒預后關鍵[11]。

本研究結果顯示，IM組兒童CD8+、CD3+明顯高于對照組，CD4+、CD4+/CD8+顯著低于對照組，表明IM患兒T細胞會因為HBV感染而被激活，導致T細胞不斷增殖，使細胞毒T 細胞以及抑制T 細胞水平增加。陳若紅等[12]研究認為相對于健康兒童，IM 組兒童CD8+水平較高，CD4+、CD4+/CD8+水平較低，該研究認為IM患兒體內細胞免疫功能損傷，同時免疫調節功能異常，機體對于病毒防御能力減弱，最終導致IM 發生。另一項研究中也顯示IM 患兒CD3+、CD8+水平較健康者高，CD4+、CD4+/CD8+水平較健康者低，細胞免疫在EBV 感染中發揮重要作用，IM 患兒細胞免疫功能異常，測定其水平可以為IM診斷提供重要依據[13]。本研究為進一步明確T 淋巴細胞亞群在IM 患者病情評估中作用，將CD8+、CD4+、CD3+、CD4+/CD8+水平應用于IM患兒病情診斷中，ROC曲線顯示各指標用于IM 診斷AUC 分別為0.850、0.848、0.810、0.771，顯示T 淋巴細胞亞群水平測定在IM 病情評估中有一定價值，間接證實其在IM發生中發揮重要作用。

本研究中急性期組兒童CD8+、CD3+顯著高于恢復期組，CD4+、CD4+/CD8+顯著低于恢復期組，表明T淋巴細胞亞群水平與患者病程關系密切，分析認為急性期CD8+、CD3+水平上調，CD4+水平下調，顯示免疫促進作用增強，免疫抑制作用減輕，這一變化有助于促進T細胞對EBV裂解循環蛋白作用，進而使EBV特異性CD8+細胞大量增殖，幫助殺滅已感染EBV B 細胞，進而促進機體對于病毒清除作用[14-15]。另有研究顯示，相對于健康者，IM 急性期CD4+、CD19+、CD16+56+降低，恢復期CD4+、CD19+、CD16+56+上升，分析認為患兒CD4+可以促進功能性細胞因子形成，抑制EBV 感染B 細胞轉化過程，而CD8+細胞則可以有效識別EBV 裂解期抗原，促進機體對于EBV 陽性B 細胞殺傷作用[16]。本研究相關性分析結果顯示外周血CD8+、CD3+水平與病情嚴重程度正相關(r=0.494、0.614)，CD4+、CD4+/CD8+水平與與病情嚴重程度負相關(r=-0.319、-0.747)，顯示不同病情嚴重程度患兒T淋巴細胞亞群水平不同。另有研究顯示痰熱熾盛型IM患兒在應用更昔洛韋聯合蒲地藍口服液進行治療，治療后患者病情減輕，CD8+、CD3+水平下降，CD4+、CD4+/CD8+水平上升，也顯示T 淋巴細胞亞群水平與患者病情關系密切[17]。相對于無肝損傷IM 患兒，IM肝損傷患兒體內CD8+毒性作用以及細胞殺傷能力未見增強，但是CD8+數目顯著增加，也顯示CD8+水平變化可能與IM患兒病情進展[18]。

綜上所述，IM 患兒體內T 淋巴細胞亞群水平異常，提示患兒免疫功能異常，且這種異常與IM 發生、病情嚴重程度關系密切，可為患兒臨床診斷、治療提供相關理論依據。