低強度脈沖超聲增效脂肪間充質干細胞源性外泌體修復糖尿病小鼠皮膚創面的實驗研究

鐘方璐 劉珺碧 蔣日月 桂 斌 王 浩 姜 楠 曹 省 周 青 鄧 傾

材料與方法

一、實驗動物、主要實驗材料及儀器

1.實驗動物：SPF 級C57BL/6 雄性小鼠36 只，4 周齡，體質量12.0~17.0 g，平均（15.0±0.5）g；雄性SD 大鼠5 只，4 周齡，體質量80.0~130.0 g，平均（110.0±3.0）g。以上動物均由武漢大學人民醫院動物實驗中心提供，本實驗經我院實驗動物倫理委員會批準［WDRM 動（福）第20210506號］。

2.主要實驗材料：CD9、Tsg101、GAPDH、Calnexin單克隆抗體（美國Proteintech 公司）；鏈脲佐菌素（德國Sigma-Aldrich 公司）；異氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司；TBST 緩沖液（10X，pH 值7.4，北京蘭杰柯科技有限公司）；DiI 及DiR 熒光標記試劑盒（美國Invitrogen 公司）；抗熒光淬滅封片劑（含DAPI）、HE 及Masson 染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；人臍靜脈內皮細胞（HUVECs，武漢普諾賽生命科技有限公司）；澳大利亞胎牛血清、低糖培養基DMEM（美國Hyclone 公司）；透明防水敷料（美國3M 公司）；小鼠CD31、α-SMA 抗體試劑盒、4%多聚甲醛組織固定液（武漢塞維爾生物科技有限公司）。

3.主要實驗儀器：正置熒光顯微鏡（BX53，日本Olympus 公司）；激光共聚焦顯微鏡（FV1200，日本Olympus 公司）；小動物成像系統（IVIS，美國Perkin Elmer 公司）；多通道超聲輻照儀（重慶醫科大學超聲影像學研究所）；納米顆粒跟蹤分析儀（ZetaView 30，德國Particle Metrix 公司）；透射電子顯微鏡（HT7700，日本HITACHI 公司）；動物血糖儀（VQpetTMH，杭州微策生物技術股份有限公司）。

二、實驗方法

（一）ADSCs-Exos的提取及鑒定

從雄性SD 大鼠雙側腹股溝脂肪中提取脂肪間充質干細胞（adipose mesenchymal stem cells，ADSCs），傳代培養后通過形態學及流式細胞術鑒定ADSCs。采用超速離心法從ADSCs 培養液中提取ADSCs-Exos，透射電子顯微鏡下觀察其形態；納米顆粒跟蹤分析儀檢測其粒徑；Western Blot檢測外泌體標志蛋白CD9和Tsg101的表達［5］。

（二）體外……