食品中金黃葡萄球菌的檢測方法研究

徐愛民 郭國棟 何曉軍

摘 要：本文針對食品中金黃葡萄球菌的檢測方法進行探究。采用文獻總結法，從金黃色葡萄球菌的特點、危害、耐藥性入手，詳細介紹了傳統培養法、免疫學方法、分子生物學、快速檢測法在食品中金黃葡萄球菌檢測中的應用，為實際檢測工作開展提供參考，保證食品質量與安全。

關鍵詞：食品；金黃葡萄球菌；檢測技術；質量安全

Study on Detection Method of Staphylococcus aureus in Food

XU Aimin， GUO Guodong， HE Xiaojun

（Heze Food and Drug Inspection and Testing Institute， Heze 274000， China）

Abstract： In this paper， the detection method of Staphylococcus aureus in food was explored. By the method of literature review， starting from the characteristics， harm and drug resistance of Staphylococcus aureus， the application of traditional culture method， immunological method， molecular biology and rapid detection method in the detection of Staphylococcus aureus in food was introduced in detail， to provide reference for the actual inspection work to ensure food quality and safety.

Keywords： food; Staphylococcus aureus; detection technology; quality and safety

金黃葡萄球菌是革蘭陽性菌，廣泛存在于空氣、水體、人與動物的排泄物中，很容易污染肉、蛋、奶等食物。其引起的食物中毒現象，是一個世界性的衛生問題[1]。近年來，隨著人們生活節奏的加快，快餐成為一種常見的用餐方式，與此同時人們更加關注食品安全問題。根據不同的食品種類，選擇合適的檢測技術方法，既能保證檢測結果的準確性，又能提高效率、有效控制成本，是從業人員的重要研究課題。本文結合筆者實踐經驗和現有研究成果，對食品中金黃葡萄球菌的檢測方法進行綜述。

1 金黃葡萄球菌概述

1.1 金黃葡萄球菌的特點

金黃葡萄球菌多為球狀或橢圓狀，一般聚集排列成葡萄串，可產生黃色的脂溶性色素。它對熱、鹽、干燥均有較強的抵抗能力，在80 ℃下可存活30 min，在10%的氯化鈉溶液中可長期存活并繁殖，在干燥的膿液、痰液中可存活2～3個月。金黃葡萄球菌一般分為A、B、C、D、E這5個類型，以A型腸毒素引起的中毒最為多見[2]。

1.2 金黃葡萄球菌的危害

正常情況下，機體可在一定程度上抵抗金黃葡萄球菌感染；但當皮膚黏膜受損、機體免疫力降低時，病原侵入機體就會產生危害。一類是侵襲性疾病，以組織感染為特征，常見如皮膚感染、傷口化膿、內臟器官感染、敗血癥等。另一類是毒素性疾病，以食物中毒、毒素休克綜合征為特征，常見如急性胃腸炎、高熱、腹瀉、皮疹等。對此，《食品安全國家標準 食品中致病菌限量》（GB 29921—2013）中，明確規定了金黃葡萄球菌在8大類食品中的檢測限量。

1.3 金黃葡萄球菌的耐藥性

隨著細菌感染引起的疾病越來越多，臨床上對于抗生素的使用不合理，導致耐藥性的產生。相關研究證實，金黃葡萄球菌對多種抗生素具有耐藥性，較為常見且嚴重的是耐甲氧西林金黃葡萄球菌、耐萬古霉素金黃葡萄球菌[3]。

2 傳統培養法在食品中金黃葡萄球菌檢測中的應用

《食品安全國家標準 食品微生物學檢 金黃色葡萄球菌檢驗》（GB 4789.10—2016）中規定傳統培養法是金黃葡萄球菌檢測的國家強制標準，可實現定性與定量檢測。該方法雖然成本低廉，但檢驗操作復雜，整個檢驗周期長，需要5 d左右才能得到檢驗結果。區楚君等[4]以冷凍肉及肉制品為對象，針對傳統培養法受雜菌干擾導致假陰性較高的問題，對分離方法進行改進，結果發現金黃色葡萄球菌的分離率從2.61%提高至19.98%，有效避免了假陰性現象的發生。

3 免疫學方法在食品中金黃葡萄球菌檢測中的應用

3.1 乳膠凝集試驗

乳膠凝集試驗是使用有抗體的彩色乳膠顆粒，對金黃葡萄球菌細胞懸液進行檢測，若懸液中有特異性抗原，就會發生凝集或沉淀。該試驗方法的優點是操作簡單、反應快速，缺點是靈敏度不高，需在檢測前進行增菌處理。以法國生物梅里埃公司為例，對樣品進行24 h增菌處理，只需20 s就能得到陽性或陰性結果。

3.2 酶聯免疫吸附法

酶聯免疫吸附法在食品檢測領域的適用范圍廣、技術成熟。其原理是利用固相載體上的抗體，捕捉樣本中的抗原，加入酶標抗體后，形成抗體-抗原-抗體復合物；最后加入顯色底物反應后，用肉眼觀察并使用酶標儀判定。該方法的靈敏度不高，需在檢測前進行增菌處理。時玉菲等[5]針對金黃色葡萄球菌A型腸毒素，使用單克隆抗體作為捕獲抗體，抗SEA兔多抗血清作為檢測抗體，建立雙抗體夾心酶聯免疫吸附法，檢測下限為1.89 μg·L-1，回收率為94%～114%，變異系數小于10%。

3.3 免疫層析檢測

免疫層析檢測利用毛細原理，在硝酸纖維素膜上固定抗體，干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品溶液中，樣品沿著毛細管移動，移動至固定有抗體的區域時，樣品中的抗原與抗體發生特異性結合，根據顏色變化達到特異性檢測目標。該方法的檢測速度快，結果準確性較高。布日額等[6]建立牛乳中金黃色葡萄球菌的膠體金免疫層析檢測方法，結果顯示最低檢出限為1.0×105 CFU·mL-1，分離鑒定符合率在83.3%～90.0%，具有操作簡單、快捷、穩定等優點。

4 分子生物學在食品中金黃葡萄球菌檢測中的應用

4.1 PCR技術

PCR即聚合酶鏈式反應，具有快速、靈敏度高、特異性好的優點。由于食品成分較為復雜，加工過程中可能破壞DNA，限制了該技術的應用。對此，通過技術創新可彌補這一缺陷，如實時熒光定量PCR、微滴式數字PCR、多重PCR等。滕要輝等[7]以速凍食品為對象，針對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌建立了多重PCR檢測方法，結果特異性為100%，可檢出菌落數低于100 CFU·g-1的菌群。

4.2 LAMP技術

LAMP即DNA環介導等溫擴增技術，適用于基因診斷，顯著特點是反應時間短、靈敏度高。郭建平等[8]采用LAMP技術，基于顏色判定對金黃色葡萄球菌進行檢測，結果表明基因組靈敏度達到0.01 fg·μL-1，菌落靈敏度達到1.9 CFU·mL-1，不僅可靠性和特異性良好，而且不需要特殊設備。

4.3 RPA技術

RPA即重組酶聚合酶恒溫擴增技術，它主要依賴于3種酶：①能與單鏈核酸結合的重組酶；②鏈置換DNA聚合酶；③單鏈DNA結合蛋白，最佳反應溫度是37 ℃。該檢測技術的優點包括：①常溫下檢測，不需要熱循環，對儀器設備要求低；②僅需少量核酸分子，在3～10 min即可完成檢測任務，且一個人就能完成操作過程；③能在同一個管中，同時進行多個擴增反應；④靈敏度高，可滿足定量檢測要求。在市場應用方面，英國TwistDX公司研發的TwistAmp產品，可在常溫下完成檢測，用時在15 min以內，尤其適用于食品安全、生物安全、體外診斷、獸醫以及農業等領域[9]。

4.4 SAT技術

SAT即實時熒光核酸恒溫擴增技術，它的標靶和擴增產物均是RNA，整個反應時間較短，熒光信號經熒光檢測儀器實時捕獲，可實時反映擴增循環情況。李桂金等[10]采用SAT法檢測食品中的金黃色葡萄球菌，并對檢測能力進行評價，結果顯示純培養物檢出限為103 CFU·mL-1，靈敏度為100%，假陰性率為0%，假陽性率為2.9%，各項結果均達標。

4.5 核酸探針技術

核酸探針技術利用核苷酸堿基順序互補的原理，對DNA或RNA片段進行標記，檢測樣本中某個特定微生物的核苷酸順序。不同微生物的基因序列不同，因此該檢測技術具有先進性。然而，食品中金黃葡萄球菌的含量少，一般不直接采用核酸探針檢查，目前只有少數公司在研究推廣該技術。例如，美國GEN-Probe公司研制的AccuProbe試劑，可在72 h內對食品中的金黃葡萄球菌進行檢測。

5 快速檢測法在食品中金黃葡萄球菌檢測中的應用

傳統培養法是金黃葡萄球菌檢測的國家強制標準，可實現定性與定量檢測。但是，食品檢測具有工作量大、范圍廣的特點，傳統培養法在操作方法和檢測周期上不具有優勢，不能滿足實際檢測需求。對此，相關企業和從業人員對傳統培養法進行優化改良，形成快速檢測技術，以顯色培養基法、鑒別培養基法、紙片法為代表，具有操作簡單、成本低廉、快速準確的優點。

5.1 顯色培養基法

顯色培養基法是利用微生物自身代謝產生的酶，加入顯色底物后反應顯色實現檢測效果，在特異性酶的作用下，通過觀察菌落的顏色對菌種進行鑒定，其特異性和靈敏度均高于傳統培養法。周霞霞等[11]對金黃色葡萄球菌標準菌株、食品樣本分離菌株采用顯色培養基進行檢驗，并與國標法、微生物鑒定藥敏分析系統的檢驗結果進行比較，結果顯示顯色培養基能快速鎖定疑似目標菌落，定量檢測與其他方法在計數值上無顯著性差異。

5.2 鑒別培養基法

鑒別培養基法是在培養基中加入試劑或化學藥品，不同微生物對這些成分的分解能力不同，指示劑對不同菌落顯示不同顏色，達到鑒別與區分的效果。法國生物梅里埃公司研制的Baird Parket+RPF培養基，加入兔血漿，在37 ℃下培養24 h，得到不透明的菌落即是金黃色葡萄球菌。仇華磊等[12]以導致奶牛發生乳腺炎的金黃色葡萄球菌為對象，在Baird-parker培養基的基礎上選擇mBP培養液，根據培養液是否渾濁、產生黑色物質，判斷奶樣中金黃色葡萄球菌對所試抗生素的敏感性。該方法簡單、快速，不需使用專門的設備，具有較高推廣價值。

5.3 紙片法

美國3M公司生產的第2代金黃色葡萄球菌快速檢測紙片，檢測過程包括兩個階段：第一階段使用改良后的B-P培養基，含有金黃色葡萄球菌的樣本培養24 h后，在紙片上呈現為暗紫色；第二階段若呈現為其他顏色，就使用含有顯色劑和DNA的確認反應片，1～3 h后金黃色葡萄球菌形成粉紅色環，其他菌落不會形成，作為鑒別判斷依據。孫鑫澤等[13]的研究中，以乳制品、熟肉制品和方便食品為對象，對比紙片法和B-P平板法對金黃色葡萄球菌的檢出率和用時，結果顯示兩種方法的檢出率無明顯差異，但紙片法檢測用時明顯縮短。

此外還有其他檢測技術，如生物素標記法、魯米諾信號化學發光法、BAX Q7全自動病原菌檢測系統等[14]。

6 結語

綜上所述，食品衛生安全直接關系到人體健康，金黃葡萄球菌檢測一直是食品檢測的一個重要項目。文章以傳統培養法、免疫學方法、分子生物學、快速檢測法為例，闡述了其在金黃葡萄球菌檢測中的應用現狀。未來，快速檢測技術因操作簡單、成本低廉、方便快捷的優點，具有良好的市場發展前景，將會成為一個重點發展方向。

參考文獻

[1]徐重新，陳蔚，謝雅晶，等.食品中金黃色葡萄球菌檢測及防控技術研究[J].農產品質量與安全，2019（3）：49-56.

[2]譚慧林，吳忠紅，金永生，等.食品中金黃色葡萄球菌的快速檢測及其評估[J].新疆農業科學，2022，59（2）：410-416.

[3]FAGAN S P，PURBA M，JAREMKO W J，et al.Pyrophosphate release acts as a kinetic checkpoint during high-fidelity DNA replication by the Staphylococcus aureus replicative polymerase PolC[J].Nucleic Acids Res， 2021，49（14）：8324-8338.

[4]區楚君，尚岱麒，吳酉芝，等.消除食品背景雜菌干擾的金黃色葡萄球菌分離方法的改進[J].中國食品學報，2021，21（5）：317-322.

[5]時玉菲，章先，謝琿，等.金黃色葡萄球菌A型腸毒素雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立及應用[J].微生物學通報，2016，43（3）：687-694.

[6]布日額，任曉峰，吳金花，等.牛乳中致病性金黃色葡萄球菌快速檢測膠體金免疫層析方法研究[J].中國預防獸醫學報，2013（11）：48-52.

[7]滕要輝，索標，艾志錄，等.速凍食品中沙門氏菌和金黃色葡萄球菌多重PCR檢測方法的建立與應用[J].食品科學，2013，34（8）：140-144.

[8]郭建平，萬佳佳，陸兆新，等.基于可視化環介導等溫擴增技術快速檢測金黃色葡萄球菌[J].食品科學，2019，40（20）：325-331.

[9]GRANT H C，LYNDSEY O H，MOATAZ F，et al.Primers and TwistAmp exo probes used in multiplex and singleplex RPA reactions to identify orfX-SCCmec junction types in MRSA isolates[J].PLoS One，2014，5（11）：138-145.

[10]李桂金，宋曉礁，張鑾，等.實時熒光核酸恒溫擴增技術檢測食品中金黃色葡萄球菌的方法評價[J].食品安全質量檢測學報，2021，12（12）：4852-4857.

[11]周霞霞，楊廣，邢家溧，等.金黃色葡萄球菌定性定量檢測中顯色培養基的效果評價[J].食品安全質量檢測學報，2020，11（24）：9329-9335.

[12]仇華磊，錢科，孫懷昌.致奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌快速鑒別及藥敏試驗選擇培養液的培養特性[J].中國獸醫學報，2008，28（10）：1208-1212.

[13]孫鑫澤，侯佳琪，張德花，等.食品中金黃色葡萄球菌的檢驗分析[J].質量安全與檢驗檢測，2021，31（1）：34-36.

[14]李寅生，王璐，張懿雪，等.BAX Q7系統快速檢測食品中金黃色葡萄球菌效果驗證[J].食品安全質量檢測學報，2020，11（10）：3256-3260.